- •Глава 1 предмет, методы и значение генетики
- •Глава 2
- •(По с. Г. Куликовой)
- •1. Диплоидные наборы хромосом у сельскохозяйственных и некоторых видов домашних, прирученных и лабораторных животных
- •Гаметогенез и мейоз
- •Глава 3
- •Закон расщепления
- •Аллели. Множественный аллелизм
- •Отклонения от ожидаемого расщепления, связанные с характером доминирования признака и летальными генами
- •2. Вывод формулы расщепления по генотипу при дигибридном скрещивании
- •Полигибридное скрещивание
- •3. Количество фенотипов и генотипов в f2 при скрещивании родителей,
- •(Новообразование)
- •Глава 4 хромосомная теория наследственности
- •Полное сцепление
- •Сцеплении:
- •Неполное сцепление
- •Карты хромосом
- •4. Фенотипические классы кроликов, полученные при анализе на сцепление трех генов
- •Глава 5 генетика пола
- •Нарушения в развитии пола
- •5. Зависимость пола дрозофилы от отношения числа х-хромосом к числу наборов аутосом (Бриджес, 1932)
- •6. Нарушения в системе половых хромосом и их фенотипическое проявление
- •Проблема регуляции пола
- •Молекулярные основы наследственности
- •Строение и типы рнк
- •Генетический код
- •Синтез белка в клетке
- •Глава 7 генетика микроорганизмов
- •700Ахвост
- •Конъюгация
- •Трансдукция
- •Трансформация
- •Глава 8 биотехнология
- •Генная инженерия
- •(По с. М. Гершензону)
- •I Химический синтез днк
- •Xj обработанные рестриктазой
- •1 Действие днк-лигазы
- •Трансформированные дочерние клетки
- •Клеточная инженерия
- •Химерные животные
- •Трансгенные животные
- •Виды изменчивости
- •9. Распределение сухостойных коров черно-пестрой породы
- •3,0 44 5,0 6Д 7.0 8,0 9,0 10,0 11,0 12.0 классы по количеству лейкоцитов (тыс.)
- •10. Определение основных статистических величин способом произведений для содержания количества лейкоцитов
- •В крови сухостойных коров (тыс. В 1 им)
- •11. Значение нормального интеграла вероятностей
- •Оценка достоверности разности между средними арифметическими двух выборочных совокупностей
- •Типы распределения
- •14. Распределение семейств по количеству больных туберкулезом коров
- •15. Значение вероятности появления редких событий при распределении Пуассона
- •3,4 3,6 4,0 4,6 5,0 5,4 5,8 Жирность молока, %
- •Критерий хи-квадрат (у2)
- •16. Соответствие фактического распределения семейств теоретически ожидаемому (биномиальному)
- •II квадрант
- •IV квадрант
- •I квадрант
- •III квадрант
- •20. Определение г для малых выборок
- •21. Корреляция частоты заболеваемости лейкозом матерей и дочерей
- •Дисперсионный анализ
- •23. Сводная таблица однофакториого дисперсионного анализа
- •Классификация мутаций
- •Хромосомные мутации
- •(По Харе, 1978)
- •Кариотипа
- •Генные мутации
- •Индуцированный мутагенез
- •Антимутагены
- •Глава 11 генетические основы онтогенеза
- •Тироксин
- •27. Продуктивность коров — дочерей и внучек разных быков-производителей в зависимости от условий кормления и выращивания (по о. А. Ивановой) Быки-производители— отцы и деды коров
- •Глава 12 генетика популяций'
- •Популяция и «чистая линия»
- •29. Снижение частоты рецессивного аллеля а при полной элиминации гомозигот aa (no Визнеру и Виллеру, 1979)
- •30. Уровень возрастания roi
- •31. Формы уродств в потомстве быка Бурхана 6083
- •Глава 13
- •32. Системы генетических групп крови
- •Наследование групп крови
- •33. Уточнение отцовства по группам крови
- •T t t гены
- •34. Некоторые биохимические полиморфные системы
- •V " j с j Гены легкой н- цепи
- •Генетика иммуноглобулинов
- •35. Аллотипы иммуноглобулинов кролика (по Кульбергу, 1985)
- •I клеткой тяжелых и легких I - -n/bJk I фенотип клетки — I а , d , d ,b,b — аллотипы иммуноглобулина кролика
- •36. Средние титры антител (1дг) поросят разных пород после вакцинации против псевдобешенства (по Rothschild и др.)
- •Ig2 титра антител
- •Клон клеток, возникший в результате мутации (2)
- •37. Мнс у домашних животных, в том числе птицы
- •38. Взаимосвязь аллелей комплекса в с заболеваемостью кур md, % (по Hansen и др.)
- •Генетические аномалии
- •Экзогенные аномалии
- •39. Частота пупочных грыж в потомстве разных быков (по а. И. Жигачеву)
- •40. Аутосомный доминантный тип наследования
- •41. Сводка доминантных признаков с летальным эффектом в гомозиготном состоянии (по Мейеру и Вегнеру, 1973)
- •42. Сцепленный с х-хромосомой тип наследования
- •43. Список генетически обусловленных аномалий у крупного рогатого скота
- •44. Частота отдельных форм врожденных аномалий у телят костромской породы (по данным племенного хозяйства за 1969—1982 гг.)
- •45. Список генетически обусловленных аномалий у свиней
- •46. Список генетически обусловленных аномалий у овец
- •I Тип наследования
- •I дефекты, встречающиеся
- •Крупный рогатый скот
- •Крупный рогатый скот
- •48. Типы центрических слияний (транслокаций) различными парами аутосом у крупного рогатого скота (по Густавссону, с нашими дополнениями)
- •49. Число осеменений на зачатие (по Ценеру и др.)
- •50. Продолжительность сервис-периода
- •52. Сравнение снижения воспроизводительной способности хряков-носителей реципрокных транслокаций и эмбриональной смертности у их потомства
- •53. Классификация гоносомальных аберраций у лошади
- •64, Xy овари-
- •54. Хромосомные аберрации в разных линиях кур (по Блому, 1974)
- •Глава 16
- •Особей из Fi
- •55. Частота заболеваемости бруцеллезом потомства некоторых быков и семейств (по в. Л. Петухову)
- •56. Заболеваемость туберкулезом животных разных пород (по Bate, Sidhu)
- •57. Частота заболеваемости туберкулезом потомства некоторых быков и семейств (по в. Л. Петухову)
- •58. Сравнение устойчивости некоторых инбредных семейств кроликов
- •По длительности жизни после стандартного введения возбудителей
- •Бычьего туберкулеза и после ингаляции человеческого туберкулеза
- •(По Lurie и Dannenberg)
- •59. Результаты скрещивания резистентных и восприимчивых к лептоспирозу животных, % (по Przytulskl и др., 1980)
- •60. Среднее число нематод в 1 г фекалий чистопородных и гибридных овец (по Jazwinski и др.)
- •61. Генетическая устойчивость к нематодам овец с разными типами гемоглобина (по Aftaif и др.)
- •Выживаемость после инфекции.Дней
- •62. Смертность от сердечной водянки телят до 30-месячного возраста, родившихся на станции Мара в Трансваале (по Bonsma)
- •К клещам
- •63. Число клещей после двух заражений (по j. Frish)
- •64. Устойчивость к клещам разных пород (по j. Frish)
- •65. Заболеваемость лейкозом дочерей резистентных и восприимчивых к лейкозу быков (по в. Л. Петухову)
- •66. Частота заболеваемости потомства лейкозом в зависимости от состояния здоровья родителей (по в. Л. Петухову)
- •67. Частота инфицированности влкрс дочерей, полученных от инфицированных и здоровых матерей (по а. Г. Незавитину)
- •68. Рак глаз и пигментация радужной оболочки (по Nishimura и др.)
- •69. Резистентность к болезни Марека инбредных линий кур и их кроссов после экспериментального заражения (по Gavora, Spenser)
- •70. Зависимость резистентное™ кур к болезни Марека от антигена в21 (по Hutt)
- •Болезни обмена веществ
- •73. Влияние породы на заболеваемость овец энзоотической атаксией и содержание меди (по Wiener)
- •I печени, мг/кг
- •Воспалительно-инфекционные осложнения
- •74. Частота болезней и деформация копыт у коров различного происхождения, % (по Косолапикову)
- •76. Частота мертворожденных и трудных отелов у некоторых пород Скандинавских стран и фрг (цит. По Дехтяреву и др.)
- •К стрессу
- •Генетических аномалий и повышения наследственной устойчивости животных к болезням
- •77. Количество нормального потомства при разных типах спаривания, необходимое для проверки гетерозиготного носительства у животных
- •Оценка генофонда пород
- •78. Устойчивость скота разных пород к трипаносомозу, тейлериозу, анаплазмозу и нематодам (по Anosa)
- •79. Устойчивость кур разных линий к лейкозу и моноцитозу (по Hatt)
- •80. Коэффициент наследуемости устойчивости (%) к некоторым болезням
- •Крупный рогатый скот
- •81. Комплексная оценка генофонда некоторых семейств (по в. Л. Петухову)
- •Селекция животных на устойчивость к болезням
- •82. Селекция морских свинок на устойчивость и чувствительность к т. Columbrtformis (no Rothwell)
- •83. Результаты селекции цыплят на резистентность к эймериозу (no Klimes, Orel)
- •84. Наследуемость некоторых механизмов защиты у молодых быков
- •Глава 8. Биотехнология. Г. А. Назарова, в. Л. Лопухов 103
- •Глава 11. Гемтлеспе основы онтогенеза. Г. А. Назарова 178
- •Глава 16. Болезни с наследственной предрасположенностью.
- •Глава 17. Методы профилактики распространенна генетических аномалий н повыпкиня наследственной устойчивости животных к болезням.
Генная инженерия
Генная инженерия — раздел биотехнологии, связанный с целенаправленным конструированием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке и синтезировать определенный продукт.
Генная инженерия решает следующие задачи:
получение генов путем их синтеза или выделения из клеток;
получение рекомбинантных молекул ДНК;
клонирование генов или генетических структур;
введение в клетку генов или генетических структур и синтез чужеродного белка.
Получение генов. Известны два способа искусственного синтеза генов вне организма — химический и ферментативный. Химическим путем в 1969 г. американский ученый Г. Корана с сотр. синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была
103
уже ранее расшифрована. Ученые сначала синтезировали фрагменты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Однако ген аланиновой тРНК при введении в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду не функционировал. Оказалось, что он не имел регуляторных элементов — промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терминальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК. В 1976 г. Г. Корана с сотр. осуществили синтез гена супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нуклеотидов. Были также синтезированы примыкающие к гену регу-ляторные участки: промотор (52 пары нуклеотидов) и терминатор (21 пара нуклеотидов) и прикрепленные к концам полимера тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген, встроенный в геном мутантного фага Т4, при введении в живую кишечную палочку оказался работоспособным^ В 1979 г. в нашей стране под руководством Ю. А. Овчинникова и М. Н. Колосова химическим путем с помощью ферментов были синтезированы гены гормонов человека и животных — энкефалина и брадикинина.
Химико-ферментативный синтез довольно широко применяют в генной инженерии для получения мелких генов. Для получения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000—3000 нуклеотидов, этот метод слишком сложен и пока неосуществим. Ученые нашли более простой способ получения таких генов.
В 1970 г. Г. Темин с сотр. обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некоторые онкогенные вирусы при помощи обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы иРНК. Дальнейшие исследования показали, что матрицами для образования копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и другие иРНК. Это открывало принципиальные возможности ферментативного синтеза любых индивидуальных генов (ДНК), используя их РНК-копии. Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. Система для синтеза представляет собой раствор, в котором содержатся все четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК, ионы магния, фермент обратная транскриптаза (ее получают из онкогенных вирусов) и матричная (информационная) РНК, кодированная геном, копию которого ставится задача снять. На иРНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, а затем на ней при помощи этого же фермента синтезируется вторая цепь ДНК. В результате получается ген по структуре такой же, как и тот, на котором была синтезирована иРНК.
Этим способом в лабораториях многих стран создан целый
104
ряд генов. В нашей стране йод руководством В. А. Энгельгардта был разработан проект «Ревертаза» — программа синтеза генов с помощью этого фермента. В осуществлении проекта участвовали ведущие отечественные и зарубежные институты. В итоге с 1974 по 1978 г. были синтезированы гены глобина голубя, кролика и человека, а также гены митохондрий печени крыс, часть гена, кодирующего иммунные белки мышей, и др.
Гены, синтезированные при помощи обратной транскриптазы, не имеют регуляторных участков и функционально неактивны. Поэтому транскрибирование копий ДНК рекомендуется проводить с про-мРНК, которые имеют все необходимые копии регуляторных частей гена.
Кроме изложенных способов ген можно получить путем выделения с помощью трансдуцирующих фагов. Таким путем в 1969 г. был впервые выделен лактозный ген кишечной палочки. Однако такой способ получения генов не всегда пригоден, так как предусматривает строгие места локализации фагов. Поэтому используются и другие приемы выделения фрагментов ДНК с нужными для переноса генами.
Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Важным событием для развития генной инженерии было открытие в клетках бактерий ферментов, способных разрезать молекулу ДНК в строго определенных местах. Ферменты эти называются рестрикти-рующими эндонуклеазами или рестриктазами, а процесс «разрезания» молекулы ДНК называется рестрикцией. С рестриктазами связаны дальнейшие успехи в молекулярной биологии. Они стали одним из главных элементов генной инженерии. Участок ДНК, узнаваемый определенной рестриктазой, включает специфическую последовательность из 6—8 пар оснований, являющихся палиндромом. Палиндромом называется последовательность ДНК, которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная от З'-конца каждой цепи. Например, рестриктаза E.coli под названием EcoRI узнает последовательность
Г I ААТТ Ц
Ц ТТАА t Г
и, прикрепляясь к ней, делает по одному однонитевому надрезу с обеих сторон, т. е. разрезает ее в симметричных участках, указанных стрелками. В результате двухцепочная молекула ДНК, если была кольцевой, вследствие разрыва приобретает линейное строение. На краях молекулы образуются липкие концы, представленные однонитевыми участками из четырех нуклеотидов: на одном конце будет последовательность ААТТ, на другом — ТТАА. При наличии липких концов молекула ДНК из линейной формы вновь способна замкнуться в кольцо без дополнительной обработки. Были обнаружены рестриктазы, узнающие самые разнообразные последовательности нуклеотидов. Например, рестриктаза EcoRII узнает последовательность ЦЦТГГ.
105
К настоящему времени известно свыше 200 рестриктаз, характерных для разных видов микроорганизмов. Это открывает новые возможности для экспериментаторов. Огромные молекулы высших организмов включают большое число мест разрезания для ферментов рестрикции. При обработке ДНК рестриктазами образуются многочисленные фрагменты ДНК, в которых представлены отдельные гены. Затем гены можно соединять в определенные структуры. Остающиеся в такой структуре разрывы нитей ДНК воссоединяются лигазой. Имеется и другой способ получения фрагментов ДНК с липкими концами. Он состоит в том, что выделенные или искусственно синтезированные участки ДНК обрабатывают эндонуклеазой, укорачивающей участки ДНК с обоих концов, после чего при помощи фермента полинуклеотидтран-сферазы пристраивают к этим концам последовательности адени-ловых и тимидиловых нуклеотидов. Длина липких поли-А и поли-Т составляет 50—100 нуклеотидов. При встраивании гена в вектор используются оба рассмотренных метода и часто совместно.
Рекйибинантные ДНК. Рекомбинантная ДНК — это искусственно полученная молекула ДНК. Она имеет форму кольца, включает ген (гены), составляющий объект генетических манипуляций, и так называемый вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном. Векторами являются те компоненты рекомбинантных ДНК, которые способны акцептировать чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетках хозяина. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства регогакона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, иначе невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или несколько маркирующих генов, чтобы по фенотипу можно было определить факт его передачи. Исследования показали, что эффективными векторами являются плазмиды. Из них в качестве векторов используются Col El, pSC 101 и др. Из вирусов в качестве векторов используют фаги X, SV 40 и их производные. Векторы придают рекомбинантной молекуле способность воспроизводиться независимо от хромосомы клетки бактерии.
Соединение вектора с фрагментом ДНК может производиться следующими путями: при помощи липких концов, образующихся в ДНК под действием эндонуклеаз рестрикции; дополнительного синтеза полинуклеотидных фрагментов каждой из цепей ДНК (поли-А и поли-Т); соединения тупых концов при помощи Т4-лигазы.
На рисунке 25 показаны ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду. Слева на иРНК при помощи обратной транскриптазы синтезируется цепь ДНК (кДНК), затем иРНК удаляют щелочью и при помощи ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь кДНК, экзонуклеазой укорачивают обе цепи ДНК и концевой трансферазой пришивают к их концам поли-Т-последовательности. На этом же рисунке
106
ПЛАЗМИДА
мРНК
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПТАЗА
РЕСТРИКТАЗА
, ЛИНЕЙНАЯ
\ ДНК
' ПЛАЗМИДЫ
мРНК
«ДНК
ЭКЗОНУКЛЕАЗА
ДНК - ПОЛИМЕРАЗА ДВУХНИТЕВАЯ кДНК
ЭКЗОНУКЛЕАЗА
КОНЦЕВАЯ ТРАНСФЕРАЗА
АААА-
•АААА
КОНЦЕВАЯ ТРАНСФЕРАЗА
ГИБРИДНАЯ МОЛЕКУЛА СО ВСТРОЕННЫМ ГЕНОМ РАЗРЫВЫ УСТРАНЯЮТСЯ ЛИГАЗОЙ
Рис. 25. Ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду