Диссертация на соискание учёной степени

cis[Ca] в растворе вблизи RyR-канала [34, 35]. Второй способ подразумевает градуальное повышение уровня cis[Ca] вблизи активных

частей канала вследствие диффузионных процессов.

реализации). На верхнем графике адаптация не наблюдается. Нижний график показывает присутствие эффекта адаптации к продолжительной стимуляции.

Адаптировано из работы [31].

Результаты экспериментов [35] по наблюдению эффекта адаптации при градуальном повышении cis[Ca] говорят о том, что только в 30% реализаций обнаруживался эффект адаптации, в остальных 70% случаях понижения вероятности пребывания канала в открытом состоянии со временем не происходило (рис. 1.14). На основании этих фактов был сделан вывод:

понижение Popen со временем зависит от скорости увеличения уровня cis[Ca] .

На основе приведенных данных можно сделать следующие выводы:

Результаты экспериментальных исследований указывают на стохастический характер динамики RyR-каналов при постоянных значениях cis[Ca] и trans[Ca] .

Зависимость вероятности Popen от уровня cis[Ca] имеет

Вероятность открытия RyR-каналов прямо пропорциональна концентрации Са2+ в люмене.

21

При резком повышении значении cis[Ca] наблюдается эффект сначала резкого повышения Popen , а затем медленного

спада значения Popen с течением времени до стационарного уровня

–адаптация к продолжительной стимуляции.

1.4Модели функционирования RyR-каналов

Стохастический характер поведения RyR-каналов при стационарных условиях является основной причиной описания данного наноскопического объекта в терминах дискретных по времени однородных марковских процессов.

Простейшей моделью, описывающей стохастическую динамику RyR-канала,

является так называемая модель «дыра в стене» (“Hole in the Wall”) [36],

которая ограничивает всю совокупность состояний канала двумя состояниями:

открытым О и закрытым С. Марковская схема данной модели имеет

простейший вид: C O , где kopen – вероятности открытия и

закрытия канала, соответственно. Следует отметить, что данные вероятности зависят от концентраций cis[Ca] и trans[Ca], однако динамика канала представляется как процесс случайного блуждания между состояниями,

которые характеризуются различными средними временами нахождения в них.

Другими словами, модели, основанные на марковских схемах, являются чисто феноменологическими.

Для более подробного моделирования процессов открытия/закрытия канала применялись более сложные марковские схемы с большим количеством состояний. Состояния канала были сгруппированы в два класса по характеру

модельных схем с различным количеством основных состояний канала, на базе которых проводилось моделирование [37].

22

Перераспределение химических связей в ходе взаимодействия активных центров белковых соединений с ионами изменяет распределение электронной плотности в реагирующих молекулах, изменяя тем самым баланс сил внутри белка, что приводит к тому, что равновесная конформация белка до и после реакции различны. Это явление называется электронно-конформационным взаимодействием, а соответствующее изменение структуры – электронно-

конформационным переходом [45, 47]. Этот переход можно также рассматривать и как конформационную релаксацию под действием нескомпенсированных сил, возникающих после акта перераспределения электронной плотности или иных изменений в активном центре белка.

Присоединение очень небольшого по размерам иона к активному центру ионного канала вызывает существенные изменения конформации белка – поворот субъединиц на расстояние порядка 10 А. Этот пример показывает,

насколько тонким является баланс сил, стабилизирующих конформацию белковой структуры.

Ярким примером являются непрерывные модели, к примеру, модель процессов открытия Са2+-активируемых K+-каналов [45]. При разработке данной математической модели авторы основывались на ряде важнейших фактов, выявленных экспериментально и характеризующих кинетику активности ионных каналов, таких как:

1)распределение кинетических параметров может иметь не экспоненциальное, а степенное распределение.

2)распределения имеют фрактальную структуру (самоподобны в различных временных масштабах [47, 48]);

3)существует скоррелированность событий ("память") в активности канала

[48].

4) кинетика переходов канала между различными состояниями определяется не только случайными, но и детерминированными силами [48].

В модели [41] конформационное состояние канала и, соответственно, его проводимость определялись с помощью введения угла отклонения подвижных

25

трансмембранных сегментов канала от центральной оси поры (рис. 1.17).

Предполагалось, что канал при отсутствии внешних воздействий может находиться в двух устойчивых состояниях (открытое и закрытое). Переходы между состояниями осуществляются благодаря воздействию тепловых флуктуаций на подвижные части сегментов. Потенциальная энергия воротного механизма (структуры) описывается функцией с двумя локальными минимумами, соответствующими открытому и закрытому состояниям канала

(рис. 1.17г).

Рис.1.17. Модель Гриневича К+-каналов. а. Структура канала с ионами К+ и молекулами воды внутри поры. . б. Схема модельного ионного канала, построенного на основе структуры К+-канала. в Упрощенная схема воротного механизма модельного канала, max –

максимальный угол, на который отклоняются подвижные части трансмембранных сегментов (ТМ2) канального белка при его открывании, - максимальный диаметр внутриклеточного устья канала, L - длина подвижной части сегмента ТМ2. г. Профиль безразмерной потенциальной энергии, которая описывает внешние воздействия на трансмембранные сегменты ТМ2 . Ec и E0 – глубины потенциальных ям в закрытом и открытом состояниях.

Таким образом, существует альтернатива теориям, основанных на марковских процессах, описывающих процессы открытия/закрытия ионных каналов. Вышеописанные модели позволяют более детально описать динамику

26

биомолекул и предполагают использование энергетического подхода к описанию конформационных изменений различных биофизических объектов.

1.5 Кооперативная динамика группы RyR-каналов. Са2+- высвобождающая единица

Начальное возрастание концентрации внутриклеточного кальция в ответ на электрическое возбуждение происходит благодаря поступлению ионов извне через L-каналы, однако такого повышения концентрации недостаточно для сокращения клетки [1, 11, 50, 51]. Внешний приток Са2+ активирует группы

RyR-каналов, являясь стимулом для последующего высвобождения Са2+ из СР и повышения уровня Са2+ в цитозоле на порядок величины. Данный триггерный процесс носит название «кальцием вызванное высвобождение кальция» (КВВК)

[1]. После высвобождения Са2+ из СР в диадное пространство и дальнейшей его диффузии в цитозоль увеличивается концентрация Са2+ вблизи миофибрилл,

что приводит к сокращению саркомера. Относительная однородность повышения концентрации Са2+ в клетке обеспечивается особым устройством СР с небольшим расстоянием (не более 1 мкм) от любой точки клетки до ближайшей высвобождающей единицы [10].

Являясь одним из ключевых процессов электромеханического сопряжения,

процесс КВВК требует тщательного экспериментального анализа и соответствующего математического моделирования.

1.6 Локальные высвобождения Са2+ в кардиомиоцитах

Важным этапом в исследовании динамики Са2+ в кардиомиоцитах являются эксперименты по изучению локальных высвобождений Са2+ в клетках при помощи конфокальной микроскопии и Са2+-чувствительного индикатора fluo-3, fluo-4, или rhod-2 [51]. Резкое локальное повышение концентрации цитозольного Са2+ в покоящейся клетке, называется Са2+ спарком [52-54].

Спарки в клетке наблюдаются с частотой около 100 в секунду [53].

На рисунке 1.18 приводятся результаты продольного сканирования сердечной клетки крысы, которая загружена индикатором fluo-3. Каждый Са2+

спарк является по форме почти сферическим с приблизительным диаметром 2

27

мкм. Как видно из рисунка 1.18в, значение концентрации покоя Са2+ около 100

нM, а значение локальных пиков концентрации от 200 до 300 нM.

Рис.1.18. Кальциевые спарки в изолированных кардиомиоцитах мыши. а. Двумерное изображение, полученное при помощи конфокальной микроскопии с применением специальных красителей. Стрелками обозначены повышения концентрации Са2+, возникающие вследствие локальных высвобождений ионов Са2+. б. Одиночный Са2+-спарк и график зависимости [Ca]i от времени,

полученный из анализа интенсивности свечения красителя. в. Трехмерный поверхностный график [Ca]i во время наблюдения спарка, отображающий временное и пространственное распространение [Ca]i . Адаптировано из [4].

Поскольку Са2+ спарки формируются кластерами RyR-каналов, они преимущественно наблюдаются вдоль саркомера и T-тубулы. На рисунке 1.18б

представлено усредненное изображение спарков перпендикулярно Т-тубулы.

1.7 Модели «общего пула»

Одной из самых распространенных теорий для описания процесса КВВК на протяжении долгого времени являлась так называемая «теория общего пула»

[55-57]. Она основана на усреднении концентрации Са2+ в сарколемме и в субклеточных пространствах. В рамках этой модели огромное количество Са2+-

высвобождающих единиц описывались одной обобщенной модельной

28

высвобождающей единицей. При этом поток Са2+ через L-каналы объединен в общий стимулирующий поток, а поток высвобождающегося Са2+ – в общий поток высвобождения. Оба этих потока направлены в один обобщенный отдел клетки, называемый субпространством (объединенное диадное пространство),

причём процесс высвобождения зависит от концентрации Са2+ в

субпространстве. Следовательно, однажды запущенное высвобождение Са2+ из СР должно повышать концентрацию Са2+ в субпространстве по принципу "всё или ничего". Согласно этой модели количество высвободившегося Са2+ не зависит от величины стимулирующего мембранного тока, что противоречит экспериментальным данным [58].

С помощью этого обобщения в целом ряде других математических моделей,

использующих теорию общего пула, исследователи пытались описать изменение концентрации Са2+ внутри клетки в течение сократительного цикла – кальциевый переход. Эти модели опирались на кинетические характеристики процессов накопления Са2+ во внутриклеточных структурах и взаимодействие с буферами [59, 60].

Объединение модели общего пула с интегративными моделями кардиомиоцитов позволило с хорошей степенью точности предсказать динамические процессы активности клетки [61].

Однако модель общего пула имеет ряд недостатков. В частности, она не способна описать следующие экспериментальные факты [29-33 ]:

явление нелинейного усиления отклика высвобождающих структур СР на увеличивающийся приток Са2+ извне – явление градуальности.

эффект быстрого завершения активного высвобождения после исчезновения стимула – termination.

эффект адаптации высвобождения к повторной стимуляции.

Как уже отмечалось, запуск процесса КВВК в сердечной клетке стимулируется незначительным повышением концентрации Са2+ в цитозоле вследствие поступления внеклеточного Са2+ через L-каналы [1].

29

Явление градуальности отклика обнаружено экспериментально и заключается в том, что при увеличении количества Са2+, поступающего извне,

происходит возрастание количества высвободившегося Са2+. Кроме того,

отклик высвобождающей системы сильно зависит от скорости повышения стимулирующего Са2+ тока [1]. Этот феномен невозможно описать в рамках модели общего пула.

Весте с тем, целый ряд экспериментов указывает на то, что в процессе высвобождения СР после его завершения концентрация Са2+ в СР не падает до нулевого уровня [52]. В модели же общего пула высвобождение Са2+

завершается при полном опустошении СР по принципу «все или ничего».

Опираясь на данные расхождения, можно сделать вывод о неспособности модели общего пула с хорошей точностью описать динамические процессы ионов Са2+ в кардиомиоците.

1.8.Теория локального контроля

Всвязи с недостатками модели общего пула, описанными ранее, возникла

необходимость разработки более обоснованных моделей электромеханического сопряжения. Изучение механизмов стимуляции высвобождения Са2+

посредством токов через L-каналы стало возможным с развитием экспериментальной техники, позволившей детально изучить одновременно потоки ионов Са2+ внутри клетки и ионные токи через L-каналы, что нашло свое применение в модели локального контроля электромеханического сопряжения [60].

В рамках этой модели утверждается, что открытие отдельного L-канала на мембране Т-тубулы стимулирует высвобождение Са2+ через кластер RyR-

каналов малого размера, расположенный вблизи данного L-канала. Таким образом, согласно этой гипотезе происходят локальные высвобождения Са2+ по принципу "все или ничего", при этом кластеры RyR-каналов пространственно удалены и функционируют практически независимо друг от друга [61].

С помощью данной теории в полной мере описывается феномен градуальности высвобождения, который достигается статистическим

30