Диссертация на соискание учёной степени

модели Мальцева-Лакатты (ML) [87, 88]. Эта модель адекватно описывает кальциевую кинетику, но обладает рядом недостатков, в частности,

пренебрежением кооперативной динамикой RyR-каналов в кластере высвобождающей единицы. Следует отметить, что ML-модель демонстрирует обратное «анти-Боудич» поведение Ca2 -«часов» («выше частота, меньше амплитуда»), однако, эффект Боудича в этой модели воспроизводится только с учетом взаимодействия внутренних и мембранных Ca2 -«часов» [89].

Автором данной диссертационной работы с помощью объединения модели кальциевой динамики с ЭК-моделью RyR-каналов впервые учтены кооперативные механизмы кинетики RyR-каналов и описан стохастический характер поведения этих каналов в процессе заполнения/высвобождения СР.

В отличие от ML-модели эффекты, связанные со стохастическим характером динамики каналов в модифицированной модели, позволяют объяснить причину увеличения амплитуды высвобождающегося Са2+ в диадное пространство с ростом частоты осцилляций изолированных внутренних Са2+-«часов», что в свою очередь позволяет на молекулярном уровне впервые описать эффект Боудича.

ЭК-модель также естественным образом вводит флуктуации частоты и амплитуды колебаний системы и шумы, нарушающие гармонический режим в модах 1 и 2. Следует отметить, что эти флуктуации заметно подавляются с ростом константы k конформационного взаимодействия между соседними RyR-

каналами.

4.2.3 Влияние взаимодействия между RyR-каналами на стабильность осцилляций системы

Далее в ходе моделирования динамики Са2+-«часов» варьировался параметр взаимодействия между каналами в диапазоне от 0 до 2.5, и

исследовалось влияние этого параметра на устойчивость осцилляций Са2+-

«часов».

141

Результаты наблюдений авторитмических осцилляций изолированных внутренних Са2+-«часов» в виртуальном эксперименте представлены на

рисунке 4.15.

Рис. 4.15. Влияние взаимодействия между каналами на стабильность осцилляций Са2+- часов. Зависимости концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях скорости заполнения люмена и параметра взаимодействия между каналами. На вставках представлены временные зависимости параметра эффективного

давления. Стрелками обозначены внеочередные высвобождения из СР. kup =0.0012

М·с-1, K up = 6·10-7 М, kdiff = 25·103 с-1, krel = 50 с-1.

Как показано на рисунке, при увеличении параметра krefill без учета

взаимодействия нарушается постоянство амплитуды зависимости CaSS (t) . Эти нарушения проявляются в частотных и амплитудных флуктуациях и

142

высвобождения при достаточно малой концентрации CajSR и, соответственно,

при отрицательном значении параметра эффективного давления p, как видно из временных зависимостей p(t) на вставках к графикам (рис.4.15).

Данные внеочередные высвобождения возникают вследствие электронной активации RyR-каналов и объясняются тем, что при достаточно большой скорости заполнения СР увеличивается частота высвобождений и Ca2 не

успевает диффундировать в цитозоль из диадного пространства. В связи с этим вероятность электронных переходов не успевает уменьшиться до нуля,

инициируя спонтанные высвобождения. Однако, как видно из рисунка,

наблюдается следующая закономерность: при увеличении параметра конформационного взаимодействия соседних RyR-каналов уменьшается уровень шумов и также количество внеочередных всплесков CaSS пример, при

высвобождений при k=0, в то время как при k=1 их число снизилось до двух.

Следовательно, усиление кооперативности привносит стабильность осцилляций Са2+-«часов».

Как было установлено экспериментально [126, 127], кооперативность RyR-

каналов обеспечивает группа специфических белков FKBP 12.6,

расположенных между каналами и стабилизирующих их динамику. При ослаблении действия данного белка с помощью различных препаратов было обнаружено нарушение самосогласованной динамики всего кластера [128],

увеличение продолжительности локальных высвобождений Са2+ в диадное пространство (длительность спарков) и нарушения ритма сокращений [129,

130].

Изучение этих нарушений играет огромную роль в исследованиях возникновения аритмии. Внеочередные колебания внутренних Са2+-«часов»,

также как и флуктуации могут являться причиной нарушения автоволновой активности клеток водителя сердечного ритма в целом, что может стать аритмогенным фактором для всего миокарда.

143

Таким образом, на основе интеграции ЭК-модели RyR-каналов в модель кальциевой динамики можно сделать вывод, что введенная в рассмотрение кооперативная динамика RyR-каналов является стабилизирующим фактором,

предотвращающим нежелательные сбои в активности клеток водителей сердечного ритма.

4.2.3 Эффект случайной остановки автоколебаний

На следующем этапе моделирования динамики Са2+-«часов» в настоящей работе исследовалось влияние скорости высвобождения Са2+ через одиночный

RyR-канал на характер осцилляций системы.

Временные зависимости относительного числа открытых каналов и концентрации высвободившегося кальция ( CaSS ) при различных значениях krel

(от 1 до 100 с-1) без учета и с учетом взаимодействия между RyR-каналами показаны на рисунке 4.16.

144

а.

б.

Рис. 4.16. Зависимости относительного числа открытых каналов в кластере и концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях скорости высвобождения (а.) при k=0; (б.) при k=2. Эксперименты

проводились при CaSS crit =0.5 10-6 М.

Эти зависимости показывают, что без учета взаимодействия при достаточно больших krel (>50 с-1) наблюдаются устойчивые релаксационные колебания Са2+-«часов», в то время как в интервале krel от 10 до 50 с-1 проявляются как гармонические колебания, так и спонтанные переходы к высокочастотным стохастическим осцилляциям с малой амплитудой вблизи определенного среднего значения CaSS (~0.2 мкМ). Дальнейшее уменьшение параметра krel ( 5

с-1) приводит к переходу осциллятора в квазиравновесное состояние.

При учете взаимодействия между каналами наблюдается стабилизация осцилляций концентрации Са2+ в диадном пространстве при krel >15 с-1 (рис. 4.16б). Дальнейшее уменьшение параметра krel приводит к спонтанным

145

переходам осциллятора в стационарное состояние, то есть к постоянному току Са2+ из СР.

Таким образом, в численных экспериментах, проведенных в данной работе,

впервые наблюдался принципиально новый эффект случайной остановки Са2+-

осциллятора. Детальный анализ этого явления показал, что он заключается в появлении в процессе высвобождения/заполнения устойчивого кластера открытых каналов (2х2, 3х2 и проч.), через который и осуществляется стационарное высвобождение ионов Са2+ в диадное пространство. На рисунке

4.17 приведен пример данного перехода в состояние стационарного высвобождения на графиках зависимостей CaSS (t) и Nopen (t) , и изображен вид решетки RyR-каналов при переходе в данное состояние (светлыми квадратами обозначены открытые, темными – закрытые каналы).

Рис. 4.17. Процесс формирования устойчивого кластера открытых каналов в процессе динамики ВЕ при достаточно сильном взаимодействии между каналами.

Анализ этого рисунка позволяет сделать вывод, что формирование устойчивого кластера 3х2 RyR-каналов не является мгновенным, а происходит следующим образом: каналы, неокруженные открытыми соседями, при понижении CajSR в процессе высвобождения туннелируют в закрытое состояние. Вероятность туннелирования отрытых каналов с открытыми соседями достаточно мала, что приводит к появлению стабильного кластера в системе, стабильность которого обеспечивает конформационное взаимодействие между RyR-каналами.

Возвращаясь к рисунку 4.16, можно заключить, что необходимыми условиями для проявления обнаруженного эффекта являются достаточно сильное взаимодействие между соседними каналами и высокий уровень

146

критического значения CaSS crit по сравнению со средним значением CaSS (t) . В

этом случае концентрация Са2+ в диадном пространстве не достигает критического значения, в связи с этим не происходят электронные переходы,

которые способны нарушить стационарность системы.

Для объяснения причин устойчивости открытого состояния каналов в кластере на рисунке 4.18 изображены конформационные потенциалы группы шести открытых каналов и соседних закрытых. Взаимодействие между открытыми каналами приводит к перенормировке конформационного потенциала в сторону стабильности открытого состояния. В связи с этим,

канал, окруженный открытыми соседями, не может быть инактивирован даже при отрицательном значении параметра эффективного давления р, так как процесс туннелирования возможен только в случае глобального минимума обратного состояния.

В связи с тем, что случайные остановки Са2+-«часов» ранее не наблюдались,

возникла необходимость более детального исследования данного эффекта, а

также изучение влияния динамических параметров на размеры и устойчивость кластеров открытых каналов.

4.2.3.1 Форма и устойчивость кластеров открытых каналов

Параметр krel определяет скорость высвобождения Са2+ через одиночный канал, являясь характеристикой только самого канала, эта величина не зависит от параметров Са2+ высвобождающей системы. В связи этим было выдвинуто предположение, что именно этот параметр может влиять на форму кластеров

147

открытых каналов в момент остановки осцилляций. В численных реализациях параметр krel варьировался в интервале от 1 до 15 с-1; параметры динамики Са2+

в системе: kup =0.0012 М·с-1, K up = 6·10-7 М, kdiff = 25·103 с-1, krel = 50 с-1, krefill =10

с-1. Данные значения выбраны в связи с анализом результатов раздела 3.3.3.

На основе численных реализаций построен график зависимости числа открытых каналов в устойчивом кластере от скорости высвобождения через одиночный канал (рис. 4.19).

Рис. 4.19. а Зависимость числа открытых каналов и относительного числа открытых каналов в устойчивых кластерах от скорости высвобождения. б. Зависимость формы устойчивых кластеров открытых RyR-каналов от скорости высвобождения.

Численные эксперименты показали, что размер кластера открытых каналов уменьшается с ростом параметра krel , тем самым обеспечивается постоянство значения потока ионов Са2+ в диадное пространство, которое прямо пропорционально произведению Nopen krel (2.24).

Наблюдения за виртуальными Са2+-«часами» показали, что самыми устойчивыми являются кластеры квадратной (2х2, 3х3, 5х5 и т.д.) и

прямоугольной формы (2х3, 2х4), особенно, если они возникают на краю решетки. Для одного и того же значения krel существует вероятность появления кластеров различной формы. Например, при krel =7.5 с-1, в различных экспериментах возможно появление одного кластера формы 2х4, двух кластеров размером 2х2 и кластера непрямоугольной формы, состоящего из 8

открытых RyR-каналов (рис. 4.19б).

148

На рисунке 4.20 приведены результаты исследования формы кластеров открытых каналов в двух модельных экспериментах при krel =6 с-1. При данном значении стабильное высвобождение происходило при десяти открытых каналах.

Рис. 4.20. Зависимости концентраций Са2+ в диадном пространстве и в люмене от времени в случае формирования квазиустойчивых (а) и устойчивых (б) кластеров открытых каналов при случайной остановке

В первом случае (рис. 4.20а) сформировался единый непрямоугольный кластер открытых каналов, состоящий из десяти каналов, а во втором случае – два кластера 2х2 и 2х3 (рис. 4.20б).

При анализе полученных результатов был сделан важный вывод – кластеры непрямоугольной формы не являются в полной мере устойчивыми, их размеры колеблются в небольшом диапазоне около среднего значения Nopen .

Зависимости CaSS (t) и CajSR (t) также флуктуируют около среднего значения

(рис. 4.20а). Возникновение кластеров прямоугольной формы (например, 2х2 и 2х3) приводит к устойчивому высвобождению Са2+ из СР (рис. 4.20б).

149

На основании вышеизложенного следует вывод, что форма устойчивых кластеров, зависит от скорости высвобождения Са2+ через одиночный канал, к

тому же при одинаковых значениях параметров системы могут образовываться кластеры различной формы и различной степени стабильности.

4.2.3.2 Характерное время перехода в стационарное состояние

Как уже отмечалось ранее, обязательным условием для проявления эффекта случайной остановки осциллятора, обнаруженного в данной работе, является достаточно сильное взаимодействие между RyR-каналами в кластере высвобождающей единицы. В связи с этим необходимо было более подробно исследовать влияние параметра взаимодействия между каналами на процесс формирования устойчивых кластеров, ведущего к переходу в стационарный режим.

Как видно из графиков зависимостей Nopen (t) при различных значениях k,

представленных на рис. 4.21, процессу перехода в стационарное состояние предшествовал переход в состояние колебаний с малой амплитудой вблизи определенного среднего значения Nopen (моменты времени, при которых происходят переходы «часов» в стационарное состояние, обозначены на рисунке стрелками).

Рис. 4.21. Зави-

симости относительного числа открытых каналов в кластере при различных значениях параметра взаимодействия между RyRканалами.

150