Диссертация на соискание учёной степени

Анализируя данную схему, можно провести параллель между моделью Са2+-

«часов» и гидродинамической моделью типа «накопление-сброс» на примере сосуда, медленно заполняемого водой (рис. 4.8а). Эта модель подробно исследована в работе [124].

а.

б.

Рис. 4.8. Гидродинамическая модель релаксационного осциллятора «накопление-сброс». б. Графики зависимостей уровня воды в сосуде

иуровня высвобождающейся жидкости от времени.

Вмодели «накопление-сброс» происходит заполнение резервуара водой с постоянной скоростью. Когда уровень жидкости достигает порогового уровня,

сосуд быстро опорожняется через сифон, и начинается новый цикл его заполнения. Процесс опорожнения является повторяющимся, то есть при постоянной подкачке с определенной скоростью заполнения извне данная система может вести себя как релаксационный осциллятор с характерным периодом колебаний T (рис. 4.8б). Форма таких колебаний очень далека от синусоидальной; она скорее напоминает последовательность импульсов. На графике зависимости уровня воды в сосуде от времени хорошо видны два характерных интервала времени t1 и t2, связанных с медленным заполнением и быстрым опорожнением, соответственно.

131

Если представить процесс с достаточно быстрым заполнением резервуара или с достаточно медленным опорожнением (времена t1 и t2 – соизмеримы), то колебания уровня воды, стекающей через сифон, будут иметь гармонический характер. При скорости заполнения большей по значению скорости сброса уровень жидкости будет держаться выше порогового, и будет происходить постоянное высвобождение воды из резервуара.

Роль «порога» в модели Са2+-«часов» играют несколько факторов. Во-

первых, критический уровень концентрации Са2+ в люмене, выше которого вероятность туннелирования RyR-каналов в открытое состояние становится ненулевой. Во-вторых, критическое значение концентрации Са2+ в диадном пространстве, выше которого начинаются электронные переходы каналов в открытое состояние, вследствие чего начинается вторичное высвобождение Са2+ из ретикулума.

С другой стороны, рассматривая электронные переходы, мы сделали предположение, что их вероятность является Са2+-зависимой. В ЭК-модели,

интегрированной в модель ВЕ, эти вероятности будут зависеть от уровня CaSS ,

в чём и состоит процесс КВВК в нашей теории.

Рассмотрим один цикл работы Са2+-«часов» (рис. 1.20). В начальный момент времени каналы в кластере находятся в закрытом состоянии и уровень CajSR

лежит ниже значения KCa , то есть p 0 . При заполнении люмена происходит перенормировка КП; в определенный момент времени значение p достигает нулевого уровня. Вследствие этого закрытое состояние становится метастабильным, начинается туннелирование небольшого числа каналов в открытое состояние. Данный процесс получил называние первичное высвобождение, вследствие которого повышается уровень CaSS . Данное повышение CaSS увеличивает вероятность электронных переходов, что приводит к процессу открытия большего количества каналов. Происходит процесс вторичного (усиленного) высвобождения.

132

Высвобождение вызывает достаточно резкое понижение концентрации Са2+

в люмене, понижается значения J rel , так оно зависит от разности концентраций

(CajSR CaSS). Понижается уровень CaSS , в связи с этим уменьшается вероятность электронной стимуляции каналов.

При понижении уровня CajSR ниже значения KCa начинается туннелирование каналов из открытого состояния в закрытое.

133

4.2 Результаты моделирования Са2+ высвобождающей единицы

Вэтом разделе диссертационной работы приведены основные результаты компьютерных экспериментов в рамках электронно-конформационной теории

имодели высвобождающей единицы. Эти эксперименты проводились с целью изучения динамики ионов Са2+ в высвобождающей единице клеток водителей сердечного ритма.

Врамках рассматриваемой модели исследовано влияние таких факторов, как скорости перетекания ионов Са2+ между компартментами клетки и взаимодействие между каналами, на стабильность авторитмических колебаний внутренних Са2+-«часов».

4.2.1 Высвобождающая единица как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор

В программном комплексе, разработанном на базе рассматриваемой модели, исследовалась динамика ионов Са2+ в высвобождающая единице,

включающей в себя кластер 9х9 RyR-каналов. Как уже отмечалось, процессы открытия/закрытия каналов в течение кальциевого цикла носят стохастический характер, и вероятность их открытия зависит от концентраций Са2+ в люмене СР и диадном пространстве. Из этого следует, что их активность должна меняться в течение Са2+-цикла в клетке.

Данный программный комплекс позволил исследовать внутренние Са2+-

«часы» и получить временные зависимости таких величин, как концентрация Са2+ в люмене ( CajSR (t) ), эффективное давления ( p(t) ), концентрация Са2+ в

диадном пространстве ( CaSS (t) ), концентрация Са2+ в цитозоле клетки (Cai (t) ) и

число открытых каналов в кластере ( Nopen (t) ). Подробно предположительный цикл работы кальциевых «часов» описан ранее в пункте 3.2.4 настоящей работы.

На рисунке 4.9 представлены результаты численного моделирования Са2+-

«часов» при следующих значениях параметров динамики Ca2 : kup =0.0012 М·с-

134

1, Kup = 6·10-7 М, kdiff = 25·103 с-1, krel = 50 с-1, krefill =1 с-1. Параметры

концентраций буферов, учитывающихся в модели, выбирались согласно работе

[80]: CQtot = 10-2 М, CMtot = 45·10-6 М, TCtot = 31·10-6 М.

На данном этапе моделирование проводилось без учета конформационного взаимодействия между RyR-каналами в решетке (k=0). Параметры ЭК модели

(2.5-2.8) выбирались такими же, как и в работе [A1]: a = 5, K = 12, hx hz 0 , Г

Рис. 4.9. Динамика Са2+-«часов» а. Зависимости CaSS (t) , Cai (t) и Ca jSR (t) и p(t) в процессе заполнения/высвобождения СР при включении

процесса КВВК.

б. Динамика решетки RyR-каналов в процессе заполнения/высвобождения. Красным цветом обозначены закрытые, желтым цветом– открытые каналы.

Как видно из рисунка, Са2+- высвобождающая единица действительно ведет себя как самоподдерживающийся осциллятор в определенном диапазоне динамических параметров.

Зависимость CaSS (t) представляет собой последовательность отдельных сигналов несинусоидальной формы с практически постоянной амплитудой

135

(0.5±0.075 мкМ). На основании этого можно сделать вывод, что высвобождающая единица при данном значении динамических параметров ведет себя как релаксационный осциллятор. Число открытых каналов также меняется периодически. В начале эксперимента все каналы решетки закрыты

(рис. 4.9б(1)), затем происходит открытие малого числа каналов, вызывая тем самым первичное высвобождение (рис. 4.9б(2)). Затем открывается большее число каналов (рис. 4.9б(3)), в связи с чем резко понижается концентрация Ca2

в люмене, что стимулирует перезагрузку системы и закрытие каналов (рис. 4.9б(4, 5)). Высвобожденный кальций диффундирует сначала в цитозоль, затем возвращается в сеть ретикулума. После этого в процессе заполнения Ca2

попадает обратно в люмен, и процесс высвобождения повторяется.

Отличительной особенностью релаксационного осциллятора является независимость его кинетических параметров от начальных условий [124, 125].

Для проверки этого эффекта построены зависимости CanSR (CajSR ) и CaSS (Cai ) в

повторяющемся цикле работы Са2+-«часов» при различных начальных условиях

(рис. 4.10).

Рис. 4.10. Зависимости

CanSR (CajSR ) и CaSS (Cai ) в

процессе динамики высвобождающей единицы в численных экспериментах при различных начальных условиях. Начальные условия обозначены черными квадратами.

136

Из графиков ясно, что выбор начальных условий не влияет на характер дальнейшей динамики системы, что подтверждает устойчивость релаксационных колебаний осциллятора при данных значениях параметров.

4.2.2 Моды динамики Са2+-«часов»

Важно отметить, что в ходе моделирования при варьировании параметра krefill и при учете кооперативной динамики RyR-каналов были выявлены и другие типы колебаний внутренних Са2+-«часов».

На рисунке 4.11 изображены зависимости концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях параметра скорости заполнения люмена.

Рис. 4.11. Типичные графики зависимости CaSS (t) в различных модах динамики ВЕ.

При варьировании параметра в широком диапазоне (0.05÷500 мс-1)

выявлено пять основных мод динамики высвобождающей единицы, которые подробно будут описаны далее.

В ходе исследования зависимости частоты и амплитуды высвобождающегося Са2+ от скорости заполнения люмена и параметра взаимодействия между каналами построена krefill –k фазовая диаграмма,

совмещенная с графиками плотности, на которых выделены различные моды поведения системы в зависимости от параметров k и krefill :

137

однако, уровень CaSS не успевает понизиться до нулевого уровня. Как видно из рисунка, осцилляции системы носят гармонический характер.

Мода 3: Динамическое квазиравновесие. (рис. 4.11(3)). При дальнейшем увеличении скорости заполнения люмена ( krefill >50 с-1) наблюдались

осцилляции высокой частоты и достаточно малой амплитуды вблизи определенного значения концентрации ( CaSS 3.1 10 6 3.7 10 6 M). Данные осцилляции вследствие малой амплитуды можно рассматривать как динамическое квазиравновесное состояние системы.

Мода 4: Динамическое равновесие. (рис. 4.11(4)). При большом значении параметра скорости заполнения ( krefill >200 с-1) открывается весь кластер RyR-

каналов. В этом случае наблюдается стабильное вытекание ионов Ca2+ в

диадное пространство с постоянной скоростью.

Рис. 4.13. Зависимости относительного числа открытых каналов (а) и концентрации Са2+ в диадном пространстве (б) от времени при различных значениях скорости заполнения люмена.

Как видно из рисунка, при увеличении krefill происходит рост амплитуды концентрации высвободившегося Са2+. Следует отметить, что в модах 1 и 2

(оптимальный режим) наблюдается эффект увеличения амплитуды концентрации высвобождающегося Ca2 с ростом частоты осцилляций (рис.

139

4.14). Одновременно с этим происходит увеличение амплитуды колебаний

Ca2 в люмене и увеличение амплитуды осцилляций числа открытых каналов

Nopen .

Рис. 4.14. Зависимость амплитуды CaSS от частоты осцилляций, иллюстрирующая закон Боудича.

Детальный анализ [А2] показал, что данный эффект может быть объяснен как результат задержки туннелирования каналов в открытое состояние. Это явление подробно описано ранее в пункте 4.1.3 настоящей работы. При большей скорости заполнения, как было показано, эффект задержки проявляется сильнее, чем при малой скорости заполнения люмена.

Данный эффект приводит к тому, что большей скорости заполнения соответствует больший уровень концентрации CajSR , при котором достигаются оптимальные условия туннелирования между ветвями конформационного потенциала. В связи с этим в процессе высвобождения открывается бόльшее число каналов и высвобождается бόльшее количество ионов Ca2 в диадное пространство.

Если учесть прямую связь силы сокращений кардиомиоцитов с концентрацией высвободившегося Ca2 [4, 70], то данный факт на молекулярном уровне объясняет давно известный принцип Боудича работы клеток водителей ритма «чаще-сильнее». Другими словами, внутренний СР-

осциллятор в ЭК-модели может работать индивидуально как источник устойчивых сердечных сокращений.

Как уже отмечалось ранее, представления о динамике ионов Са2+ и о принципах работы внутренних Са2+-«часов» в данной работе основываются на

140