Диссертация на соискание учёной степени

Как видно из рисунка, величина closing падает с увеличением a u , при этом,

с учетом процесса туннелирования в эксперименте канал закрывается быстрее.

Этот эксперимент проводился на малых интервалах времени (t = 15 мс).

Пренебрегая процессами переходов в инактивационное состояние, процесс

закрытия канала можно описать с помощью простейшей марковской схемы:

где C – закрытое состояние, O – открытое состояние.

Рассмотрим случай при tun =0. Вероятности пребывания канала в состояниях О и С описываются системой дифференциальных уравнений Колмогорова:

dPC (t) a u PO (t) a b PC (t)

dt (3.19)

dPO (t) a b PC (t) a u PO (t), dt

где PC (t) и PO (t) – вероятности пребывания канала в состояниях О и С,

соответственно.

В начальный момент времени все каналы находятся в открытом состоянии,

поэтому начальные условия для уравнений (3.19) следующие: PC (t 0) 0 ,

PO (t 0) 1.

С учетом этих начальных условий решение системы (3.19) выглядит как:

На рисунке 3.22 представлены графики зависимости Popen (t) при a u =0.2

мс-1 ( dt 0.05 мс, a b =0.2 мс-1), полученные по результатам численных экспериментов, а также кривая, соответствующая аналитическому решению уравнений Колмогорова (3.20).

102

Впервые явление медленного понижения активности канала при длительном стимуле было обнаружено экспериментально в 1993 году [25] и получило название адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции. Результаты исследований из работы [25] представлены на рисунке 3.23б. Подробно этот эффект описан ранее в первой главе настоящей работы.

Врамках данной работы исследована вероятность пребывания канала в открытом состоянии при учете всех видов электронных переходов, включая переходы в инактивированное состояние, на больших интервалах времени (t > 3 c).

Также как и в экспериментах, описанных выше, исследовалась динамика ансамбля независимых RyR-каналов, в начальный момент времени все каналы находились в закрытом состоянии.

Вмомент времени t=0 уровень cis[Ca] резко повышается до 1 мкМ, при этом, вероятности электронных переходов становятся больше нуля.

На рисунке 3.23 представлены графики зависимости Popen и cis[Ca] от

времени.

Условно график зависимости P (t) можно разбить на три участка (рис.

open

3.23а). На первом из них (0<t<100 мс) происходит активация каналов в

104

Далее в интервале 100 мс < t < 2.5 с наблюдается медленный спад Popen , до

стационарного значения P 0.1 (участок II). После этого система приходит в

open

динамическое равновесие (участок III).

На больших интервалах времени (~3c) можно пренебречь медленной конформационной динамикой, поэтому на участке II переходы RyR-канала из одного состояния в другое можно описать с помощью марковского процесса

(3.10). Уравнения (3.11) имеют следующие начальные условия:

Точные решения этих уравнений (аналитический вид здесь не приводится)

представлены в виде графиков на рисунке 3.24а, 3.24б. Для сравнения с точным решением (сплошная линия) на рисунке 3.24а также приведены данные численных экспериментов. Эти результаты изображены ранее на рисунке 3.23а.

105

t, c

Рис. 3.24. Эффект адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции а. Зависимости вероятностей нахождения канала

воткрытом состоянии от времени, полученные из численных экспериментов и из точного решения уравнений Колмогорова. б. Временные зависимости нахождения канала

взакрытом и инактивированном состоянии, полученные из уравнений (3.11). Интенсивности электронных переходов при

Из анализа рисунка 3.24а можно сделать вывод, что результаты моделирования хорошо согласуются с точными решениями уравнений

медленный спад активности канала на этом промежутке времени. При анализе данных численных экспериментов было выявлено, что стационарный уровень

106

P (t) проявляется в связи со стремлением канала к динамическому

open

равновесию между переходами в состояния: O, C и I, что подтверждает выход на стационарный уровень вероятностей переходов в состояние О и I (рис.

3.24б).

Рис. 3.25. Экспериментальное исследование влияния двух последовательных увеличений уровня cis[Ca] на активность одиночного RyR-канала. а. Реализации кальциевого тока через RyR-канал. Верхний уровень соответствует открытому состоянию канала. б. Временная зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии. в. Уровень концентрации Са2+ в cis-части. Адаптировано из работы [25].

При последующих резких повышениях уровня cis[Ca] в экспериментальных работах также наблюдался эффект адаптации (рис.3.25б).

Серия численных экспериментов, проведенных в данной работе на основе ЭК-теории показала, что данная модель позволяет воспроизвести вышеописанные экспериментальные данные (рис. 3.26).

Видно (рис. 3.26), что при повторном повышении cis[Ca] наблюдается медленное понижение Popen до стационарного уровня ( 0.1), при этом следует

107

указать на тот факт, что эффект адаптации проявляется даже в том случае,

когда уровень cis[Ca] перед резким повышением принимает достаточно большие значения ( 0.25 мкМ).

Вышеописанный эффект имеет большое значение для сердечной клетки, так как RyR-канал адаптируется к установившемуся уровню cis[Ca], сохраняя свою способность реагировать на следующее повышение cis[Ca]. Процесс КВВК должен быть самовосстанавливающимся, так как Са2+, высвобожденный из СР должен быть возвращен в СР и активировать следующее высвобождение Са2+,

при этом адаптация является своеобразным эффектом негативного контроля

(проверяет отсутствие нежелательных явлений и/или их повторения).

Как показывает большинство экспериментов в сердечных клетках [32, 120],

на завершение процесса высвобождения Са2+ в диадное пространство в большей степени влияет опустошение СР, но по мнению некоторых исследователей [52], понижение активности RyR-каналов во времени вследствие адаптации также вносит вклад в завершение высвобождения.

Введение впервые в данной работе в электронно-конформационную модель высокоэнергетического адсорбционного инактивационного состояния позволило описать процессы связывания ионов Са2+ с инактивационным центром RyR-канала, которые имеют меньшую вероятность, чем связывание с активационным центром. Возможность перехода в инактивацинное состояние объясняет существование длительных интервалов, наблюдаемых в эксперименте, на которых проводимость RyR-канала равна нулю [18].

3.7 Динамика одиночного RyR-канала при установившемся уровне cis[Ca]

На следующем этапе данной работы исследовалось поведение изолированных RyR-каналов при установившемся уровне cis[Ca] после выхода в динамическое равновесие (участок III на рисунке 3.23а).

Динамическое равновесие определяется постоянным значением средней вероятности пребывания RyR-канала в открытом состоянии на больших интервалах времени. Как показывают результаты экспериментов по изучению

108

кинетических свойств RyR-канала при стационарных условиях, средняя вероятность пребывания канала в открытом состоянии напрямую зависит от уровня cis[Ca] [13, 17, 20].

В связи с этим в настоящей работе необходимо было исследовать активность одиночного RyR-канала при стационарных условиях и установить способность электронно-конформационной теории объяснить эффекты динамики RyR-

канала при постоянном уровне cis[Ca], ранее выявленные экспериментально.

3.7.1 Зависимость активности RyR-канала от времени

В начале эксперимента по исследованию активности RyR-каналов все каналы в ансамбле были закрыты, а в момент времени t=0 при cis[Ca]>0

происходил быстрый процесс активации и дальнейшей процесс медленной адаптации каналов. Регистрация активности канала в численных экспериментах проводилась, после выхода на стационарный режим, начиная с момента t=3 c.

На рисунке 3.26 представлены результаты численных экспериментов по наблюдению активности RyR-канала при стационарных условиях. Данный эксперимент проводился при следующих значениях интенсивностей переходов:

Эти значения соответствуют значению cis[Ca]=0.5 мкМ согласно формуле (2.6).

Активность канала исследовалась на малых интервалах длительностью 10 мс,

что позволило построить график зависимости вероятности пребывания RyR-

канала в открытом состоянии от времени (рис. 3.27б).

109

Рис. 3.27. а. Зависимость активности RyR-канала при стационарных условиях от времени. Нулевому уровню соответствует закрытое состояние. б. Зависимость вероятности пребывания канала в открытом состоянии от времени (вычислялась на временном шаге 10 мс). в. Представление активности канала в различных модах (H, L и I) от времени.

Как видно из графика, зависимость вероятности пребывания канала в

открытом состоянии P (t) является неоднородной, и динамика RyR-канала

open

при стационарных условиях носит стохастический характер.

Гистограмма распределения вероятности пребывания канала в открытом состоянии (рис. 3.28) имеет два локальных максимума в точках,

разделяет так называемые моды активности RyR-канала на текущем

активности L. Значение вероятности Popen 0 определяет нулевую активность

канала (мода I). Зависимость положения канала в модах H, L и I в зависимости от времени изображена на рисунке 3.27в. Информация о положении канала в той или иной моде позволяет более детально описать его активность в текущий момент времени.

110