Донецкая Э.Г.-А., Зрячкин Н.И., Кутырев В.В. и др. Руководство по клинической микробиологии

Глава 1. Организация работ с возбудителями инфекционных и инвазивных заболеваний человека

4.Помещения лаборатории должны быть разделены на «чистую» зону, где не проводят работы с микроорганизмами и их хранение, и «заразную» зону, где осуществляют манипуляции с ПБА III–IV групп и их хранение.

5.Должна быть обеспечена поточность движения материала.

6.Лаборатории должны иметь набор рабочих и вспомогательных помещений (комнат). Набор помещений и их оснащение оборудованием могут варьироваться в зависимости от конкретных целей и задач лаборатории.

7.В «чистой» зоне лабораторий должны располагаться следующие помещения:

– гардероб для верхней одежды;

– помещения для проведения подготовительных работ (препараторская, моечная, приготовление и разлив питательных сред и др.);

– помещение для стерилизации питательных сред и лабораторной посуды (стерилизационная);

– помещение с холодильной камерой или холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов;

– помещение для работы с документами и литературой;

– помещение для отдыха и приема пищи;

– кабинет заведующего;

– помещение для хранения и надевания рабочей одежды;

– подсобные помещения;

– туалет.

8.Для работы с ПБА III–IV групп в «заразной» зоне должны размещаться:

– помещение для приема и регистрации материала (проб);

– боксированные помещения с предбоксами или помещения, оснащенные боксами микробиологической безопасности;

– помещения для проведения бактериологических (вирусологических) исследований;

– помещения для проведения иммунологических исследований;

– помещение для люминесцентной микроскопии;

– помещения для ПЦР-диагностики;

– помещение для паразитологических исследований;

– помещение для проведения зооэнтомологических работ;

– помещение для работы с лабораторными животными (заражение, вскрытие);

11

Руководство по клинической микробиологии

–помещение для содержания инфицированных лабораторных животных;

–термостатная комната;

–помещение для обеззараживания (автоклавная).

9.На границе «чистой» и «заразной» зон во вновь строящихся или реконструируемых лабораториях должно быть предусмотрено устройство санитарных пропускников с душевой на границе «чистой»

и«заразной» зон.

10.В лабораториях, проводящих исследования с ПБА только IV группы, в «заразной» зоне должны располагаться:

– комната для посевов;

– комната для проведения исследований с ПБА;

– комната для обеззараживания и стерилизации;

– душевая в санитарном пропускнике на границе «чистой» и «заразной» зон.

Обязательна маркировка автоклавов, столов, стеллажей и разделение работ по обращению с инфекционным и чистым материалами во времени.

11.При расположении в одном блоке нескольких микробиологических лабораторий общими для них могут быть: блок для работы с инфицированными животными, автоклавные для обеззараживания, моечные, комнаты для приготовления питательных сред и другие вспомогательные помещения.

12.Внутренняя отделка помещений должна быть выполнена в соответствии с их функциональным назначением и гигиеническими нормативами. Поверхности пола, стен, потолка в лабораторных помещениях «заразной» зоны должны быть гладкими, без щелей, устойчивыми к многократному действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы должны быть не скользкими, иметь гидроизоляцию.

13.Окна и двери помещений «заразной» зоны лаборатории должны быть герметичными. Окна цокольного и первого этажей независимо от наличия охранной сигнализации должны быть оснащены металлическими решетками, не нарушающими правил пожарной безопасности. Двери должны иметь запирающие устройства.

14.Приборы, оборудование и средства измерений, используемые в работе лаборатории, должны быть аттестованы, технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации с учетом требований биологической безопасности. Средства

12

Глава 1. Организация работ с возбудителями инфекционных и инвазивных заболеваний человека

измерения подвергают метрологическому контролю в установленные сроки.

15.Лабораторное оборудование и мебель (столы, стеллажи для содержанияживотных,стульяит.д.)должныбытьгладкими,безострых краев и шероховатостей и иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин. В помещениях «заразной» зоны не допускается использование мебели из древесины и с мягким покрытием.

16.Ширина проходов к рабочим местам или между двумя рядами выступающего оборудования должна быть не менее 1,5 м.

17.Помещения «заразной» зоны должны быть оборудованы бактерицидными облучателями для обеззараживания воздуха и поверхностей в соответствии с нормативами.

18.Помещения лабораторий должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.

19.Лабораторные помещения должны быть оборудованы пожарной сигнализацией и обеспечены средствами пожаротушения в соответствии с требованиями пожарной безопасности.

20.Все жидкие отходы, образующиеся в процессе работы в «заразной» зоне, перед сбросом в канализационную систему подлежат обязательному химическому или термическому обеззараживанию.

21.Помещения блока для работы и содержания инфицированных животных, боксированные помещения, микробиологические комнаты должны быть оборудованы автономными системами приточно-вытяж- ной вентиляции с механическим побуждением, оснащенными фильтрами тонкой очистки на выходе или боксами микробиологической безопасности II класса.

22.Для поддержания нормируемых параметров микроклимата могут быть установлены кондиционеры в рабочих комнатах и боксированных помещениях. На время работы с ПБА кондиционеры должны быть выключены. Фильтрующие элементы кондиционеров должны периодически (не реже – одного раза в три месяца) подвергаться очистке от механических частиц и дезинфекции. Не допускается установка кондиционеров в комнатах для содержания зараженных животных.

23.Для работы с ПБА должны применяться боксы микробиологической безопасности II класса.

Все работы в боксах микробиологической безопасности проводят на поддонах с салфетками, смоченными дезинфицирующим раствором.

13

Руководство по клинической микробиологии

1.3. Требования к проведению работ в лаборатории

1.Доставка в лабораторию материала для исследования осуществляется в контейнерах, биксах или в сумках-холодильниках. Доставляемые емкости с жидкими материалами должны быть закрыты пробками (крышками), исключающими выливание содержимого во время транспортирования. Дно контейнеров, содержащих емкости с ПБА, должно быть покрыто адсорбирующим материалом (марлевая салфетка, ткань, вата и др.), контейнеры, боксы или сумки-холодильники должны быть промаркированы и иметь международный знак «Биологическая опасность». Не допускается доставка материала в хозяйственных сумках, чемоданах, портфелях и других предметах личного пользования.

2.Прием и разбор доставленного материала (проб) должны проводиться с соблюдением мер предосторожности. Емкости с ПБА должны помещаться на поднос или лоток, покрытый многослойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором. Персонал должен бытьодетвзащитнуюодежду,использоватьмаскуирезиновыеперчатки.

3.В боксированных помещениях «заразной» зоны лаборатории (или в боксах микробиологической безопасности) проводятся следующие виды работ:

– идентификация и изучение выделенных штаммов микроорганизмов;

– приготовление суспензий;

– центрифугирование ПБА, сушка, дезинтеграция, другие операции с вероятным образованием аэрозоля;

– заражение культуры клеток и куриных эмбрионов;

– работа с лиофилизированными ПБА;

– работа по ведению коллекционных штаммов;

– заражение, вскрытие с животных;

– содержание инфицированных животных.

4.Во время работы двери боксов и предбоксов должны быть закрыты. Выход из боксов во время проведения работ не допускается.

Бокс должен быть оснащен средствами аварийной сигнализации,

апредбокс – средствами пожаротушения.

5.При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройствами.

14

Глава 1. Организация работ с возбудителями инфекционных и инвазивных заболеваний человека

6.Бактериологическая петля должна быть замкнута в непрерывное кольцо и иметь плечо длиной не более 6 см. Допускается использование одноразовых промышленно изготовленных петель с большей длиной плеча.

7.Перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы и т.д. должны быть проверены на целостность и исправность.

8.По окончании работы все объекты, содержащие ПБА, должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы и т.д.); в обязательном порядке проводится обеззараживание рабочих поверхностей столов дезинфицирующими растворами.

9.Использованные пипетки полностью погружаются в дезинфицирующий раствор, избегая образования в каналах пузырьков воздуха.

10.Остатки ПБА, использованная посуда, твердые отходы из «заразной» зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или обеззараживаться на месте. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещается.

11.Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях с соответствующей маркировкой.

13.Пробирки и флаконы со сгустками крови обеззараживают с использованием дезинфицирующих растворов или физическими методами дезинфекции с применением оборудования, разрешенного для этих целей в установленном порядке. Вытряхивание необеззараженного сгустка крови из пробирки (флакона) запрещается. При погружении

вдезинфицирующий раствор емкостей со сгустками крови необходимо соблюдать осторожность. Емкость берут анатомическим пинцетом так, чтобы одна его бранша вошла немного внутрь, и погружают ее в наклонном положении до полного заполнения раствором. При правильном погружении воздушные пузыри не образуются и емкость опускается на дно. После погружения всех емкостей пинцет обеззараживают.

14.После завершения работы помещение «заразной» зоны лаборатории запирают и опечатывают. При наличии коллекции культур микроорганизмов дополнительно опечатывают их хранилища. Опечатывание и снятие печатей производят сотрудники лаборатории, имеющие разрешение руководителя.

15.Прием посетителей, хранение пищевых продуктов, прием пищи разрешаются только в специально отведенных местах в «чистой» зоне лаборатории.

15

Руководство по клинической микробиологии

16.Вынос из лаборатории оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, реактивов, инструментов и другого производится только после их дезинфекции и с разрешения руководителя лаборатории.

17.В «заразной» зоне лаборатории не допускается:

–оставлять после окончания работы на рабочих местах нефиксированные мазки или посуду с ПБА;

–пипетировать ртом, переливать жидкий инфекционный материал через край сосуда (пробирки, колбы, флакона и др.);

–хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику и прочее, а также продукты питания;

–курить, пить воду;

–оставлять рабочее место во время выполнения любого вида работ с ПБА;

–сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания;

–удалять необеззараженные сгустки крови из пробирок, флаконов вытряхиванием.

18. Перенос материала для обеззараживания внутри подразделения проводится в специальных емкостях (баках, биксах, ведрах с крышками).

19. Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в «чистой» зоне лаборатории

сприменением моющих средств, в «заразной» зоне с применением дезинфектантов.

20. В боксированных помещениях проводится еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств. Поверхности в помещениях, аппараты, приборы протирают дезинфицирующим раствором, стены обрабатывают на высоту до 2 м. После влажной уборки включают бактерицидные лампы. Эксплуатация бактерицидных облучателей должна осуществляться в соответствии с действующими нормативно-методическими документами по использованию ультрафиолетового облучения для воздуха помещений, утвержденными в установленном порядке. Стеклянные поверхности бактерицидных ламп следует протирать через час после ее отключения ветошью, смоченной спиртом, не реже – одного раза в неделю.

16

ГЛАВА 2. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА И ДИСБАКТЕРИОЗ

2.1. Нормальная микрофлора организма человека

Организм человека – сложнейший «надорганизм». «Метагеном» этого суперорганизма состоит из генов собственно Homo sapiens и генов присутствующих микроорганизмов, колонизирующих его тело.

Нормальная микрофлора здорового человека выступает как единое целое (своеобразный экстракорпоральный орган), согласованно работающий в интересах всей системы организма хозяина, в котором она локализована.

Ворганизме человека присутствуют более квадриллиона микроорганизмов, что в 100 раз превышает число соматических клеток человека.

Человек по количеству соответствующих клеток больше прокариотический (более 90%), чем эукариотический организм (менее 10%) организм.

Вдезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) человека идентифицировано 23 тыс., в микробиоте – 3,5−10 млн генов. Количество видов бактерий, обнаруживаемых у этого суперорганизма, колеблется от 2,5 до 10 тыс. В фекалиях человека выявлено также порядка 1200 вирусных генотипов. Многие хромосомные гены человека (более 80%) имеют микробное происхождение.

Нормальная микрофлора присутствует в организме человека в виде фиксированных к определенным рецепторам микроколоний бактерий, заключенных в биопленку, представляющую собой, помимо микроколоний микроорганизмов, экзополисахариды различного состава микробногопроисхожденияимуцин,образуемыйбокаловиднымиклеткамислизистых.Благодаряналичиювбиопленкесложнойиразветвлен-

18

Глава 2. Нормальная микрофлора организма человека и дисбактериоз

ной системы кооперации между многочисленными и разнообразными микробными популяциями, любой попадающий естественным путем в организм субстрат в результате микробной трансформации превращается через каскад реакций в конечный или промежуточный продукт с той или иной биологической или фармакологической активностью.

Нормальную микробиоту рассматривают как совокупность множества микроорганизмов, характеризующихся определенным составом

изанимающих тот или иной биотоп в организме человека.

Влюбом микробиоцинозе различают постоянно встречающиеся виды (автохтонная флора) и добавочные виды (аллохтонная флора). Количество постоянных видов относительно невелико, зато численно они всегда представлены наиболее обильно.

Уже с первых мгновений появления ребенка на свет кожа и слизистые оболочки человека обсеменяются микроорганизмами, число и разнообразие которых определяются генетической предрасположенностью, составом микрофлоры матери, механизмами родов, санитарным состоянием среды, в которых они проходили и типом вскармливания.

К настоящему времени выявлены некоторые общие закономерности заселения желудочно-кишечного тракта человека микроорганизмами. Установлено, что в первые часы и дни в кишечнике новорожденных встречаются преимущественно микрококки, стафилококки, энтерококки и клостридии. Впоследствии появляются энтеробактерии (кишечные палочки), лактобациллы и бифидобактерии. Первые микроорганизмы, обнаруживаемые у новорожденных, не обязательно те, которые доминируют в фекальной и вагинальной флоре матери. Со временем в кишечнике появляются, а затем начинают преобладать неспороносные облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии, эубактерии, бактероиды, стрептококки, клостридии, спириллы и др.). Для того чтобы микробная экология пищеварительного тракта новорожденных по своему составу приблизилась к таковой у взрослых, требуется несколько лет. Основу нормальной микрофлоры кожи и поверхности мукозных мембран составляют анаэробные микроорганизмы. В полости рта встречаются более 300 видов микроорганизмов. Их количество в слюне достигает 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл, а соотношение анаэробов и аэробов составляет 1 : 10. В соско-

бах с гингивы концентрация бактерий может составлять 1012 КОЕ на 1 г, при этом указанное соотношение сдвигается и становится 1000 : 1. Микроорганизмы в верхнем отделе кишечника отличаются по составу

19

Руководство по клинической микробиологии

от таковых нижнего отдела. В желудке и тонкой кишке микрофлора отражает таковую полости рта, и их концентрация не превышает в норме 105 КОЕ на 1 г кишечного содержимого. Особенно обильна микрофлора толстого кишечника, где содержание бактерий достигает 1012–13 КОЕ на 1 г содержимого (суммарно в кишечнике взрослого человека находится более 1,5 кг микроорганизмов). Число анаэробных микроорганизмов в 100–1000 раз превышает таковое аэробных бактерий. Количество анаэробных микроорганизмов, присутствующих в женских гениталиях, достигает 108 КОЕ на 1 г, что более чем в 10 раз превышает число обнаруживаемых в этой области аэробных бактерий. В глубоких слоях кожи анаэробные бактерии также присутствуют в преобладающем количестве.

Состав микробиоты различается в зависимости от исследуемого биотопа, даже в одном биотопе он может меняться в различных условиях жизни или состоянии организма.

Общее количество видов бактерий, обнаруживаемых в пищеварительном тракте человека, колеблется от 10 до 30 тыс., штаммов – до 70 тыс. Среди доминирующих видов бактерий (160–300) лишь 18 обнаруживается у всех лиц, 75 – у 50%, 57 видов обнаруживается у 90% лиц; видовой состав относительно стабилен у конкретного человека и имеет выраженный индивидуальный характер как на видовом, так и в особенности на штаммовом уровне (различия среди штаммов могут достигать 25% и более их генома). Содержание бактерий (КОЕ/г) и количество видов между отдельными индивидуумами может различаться в 12–2200 раз. Только представители 700–1000 видов кишечных бактерий могут быть культивированы. Преобладают представители групп

Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (род Bacteroides) и Firmicutes

(прежде всего роды Clostridium и Eubacterium); каждая из перечисленных групп составляет до 30–40% всех обнаруживаемых в фекалиях и на слизистых толстого кишечника микроорганизмов. За ними следуют

Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria. У многих взрослых людей в толстой кишке присутствуют значительные количества метанообразующих или окисляющих метан Archaea.

Большие популяции резидентных микроорганизмов вовлечены в рост и развитие организма хозяина, влияют практически на все его физиологические функции, иммунные, метаболические, поведенческие и регуляторные реакции и ответы, продуцируют разнообразные сигналы, которые определяют его здоровье, начиная от антенатального периода до глубокой старости.

20