1. Выполните тестовые задания (30 баллов)

1 Для выращивания дрожжей, бактерий и плесневых грибов широко используют среды с…солодовым или пивным суслом .

2 Если на клетки микроорганизмов воздействуют слишком высокие концентрации веществ в растворе, может произойти…плазмолиз.

3 Для анаэробных микроорганизмов наименьшее и наивысшее значение рН равно. 0-12.

4 Какие микроорганизмы желательно использовать для биосинтетических процессов?термофильные.

5 Дезинфекция — уничтожение патогенной микрофлоры с помощью… химических веществ.

6 В культуральной жидкости, полученной после ферментации, суспендированы…микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты.

7 Методами химической технологии из культуральной жидкости получают… биомассу или нужное вещество — спирт, кислоту, аминокислоту антибиотики и пр.}

8 При использовании метода поверхностных культур, на каких средах выращивают микроорганизм.. твердых средах или на жидких средах, залитых тонким слоем (2—20 см) в специальные кюветы.

9 Какой объем питательной среды при периодическом процессе культивирования загружают в аппарат?весь объем.

10 За время культивирования изменяется….состав питательной среды.

11 Какое количество нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) содержит микробная биомасса?5-30%

12 Какие микроорганизмы синтезируют витамин В 12. бактерии (пропионовые, метанобразующие).

13 Какие микроорганизмы содержат каратиноиды? дрожжи.

14 Какие полисахариды придают прочность клеточной стенке дрожжей? глюкан.

15 Какое количество липидов по сухой массе могут накопить дрожжи (Rhodotorula gracilis, Endomyces vernalis, Torulopsis lipofera)до 50%.

16 Чем выше температура и влажность клеточной массы, тем выше? летальность.

17 Производственные установки для стерилизации стерилизуют питательную среду паром при давлении 150—200 кПа.

18 Бактерициды (фунгициды) —• вещества (или физические факторы), уничтожающие…грибы.

19Для стерилизации газов и жидкостей используют метод…ультрафильтрации.

20 Какое количество фагов может быть в клетке? B) более 1000.

21 Культуры бактерии, содержащие профаги называют… B) зогенными.

22 Фаги погибают под действием в течение 30 мин температуры A) 100°С и выше.

23Чистые культуры- это… E) однородные популяции микроорганизмов одного определенного вида и штамма

24Чистую культуру обычно получают из … A) одной изолированной клетки.

25 Для изолирования культур используют …. A) метод Линднера.

26Пробирки с чистыми культурами хранят в холодильнике при температуре... B) 6-8о С.

27 Какие методы используют для выращивания аэробных микроорганизмов? E) глубинный и поверхностный

28 В микробиологическом синтезе большое значение имеет…. A) реакция рН среды.

29Источниками азота в питательной среде могут быть…. E) белки, пептиды, аминокислоты, соли аммония или аммиака, нитраты, а также атмосферный азот.

30 Какое количество азота в питательной среде остается неиспользованным? A) 5%.

2.Биомасса водородных бактекрий (30 баллов). 1.Водородные бактерии способны активировать молекулярный водород благодаря наличию гидрогеназ и, таким образом, получать энергию в виде АТФ для синтетических процессов и фиксации углекислого газа через восстановительный пентозофосфатный цикл. Сырьем для получения биомассы в данном случае являются газы С02, Нг, 02 и смесь минеральных солей. Наиболее хорошо изученные представители этой группы Hydrogenomonas имеют форму палочек с жгутиками. Их легко выделить из почвы на простой минеральной среде в виде накопительной культуры, причем необходима смесь газов — кислорода, водорода и углекислого газа.

2.Для получения бактериальной биомассы можно, например, использовать Hydrogenomonas eutropha. Культуру сначала размножают в стерильных условиях в колбах с магнитными мешалками на среде Шлегеля при периодическом продувании среды газовой смесью (в % ) : Н2 — 75; 0 2—15; С02—10. Затем выращивание продолжают в рабочих ферментаторах с высокой массообменной характеристикой. Посевной материал должен содержать биомассы 3—5 г на 1 л культуральной жидкости. Для ферментации используют среду следующего состава (в г/л): хлорид аммония — 1,5; одно- и двузамещенные фосфаты калия — по 2,5; двузамещенный фосфат натрия—1; сульфат магния — 0,5; цитрат железа — 0,08; хлорид кальция — 0,02 и 3 мг/мл стандартного раствора микроэлементов Хоагланда. Оптимальное значение реакции среды 6,8, температуры — 31—32°С. Во время ферментации среда интенсивно перемешивается и продувается газовой смесью. Процесс контролируется по изменению парциального давления кислорода и углекислого газа.

Ферментация хорошо идет по непрерывной схеме культивирования, при этом не существует опасности загрязнения посторонней микрофлорой, так как Hydrogenomonas имеет большую скорость роста, а среда выращивания непригодна для гетеротрофных микроорганизмов. Удельная скорость роста д., а следовательно, и скорость протока D зависят от желаемой концентрации биомассы. При D = 0,4 ч-1 концентрация биомассы устанавливается около 4 г/л.

В периодическом режиме выращивания достигается концентрация биомассы до 50 г на I л культуральной жидкости, что дает продуктивность системы, равную 4,5 кг/ч биомассы на I м3 емкости. Необходимо отметить, что в настоящее время существуют ферментаторы с вмонтированными электродами для электролиза воды во время ферментации. В этом случае водород и кислород образуются прямо в культуральной жидкости, но этот процесс требует больших затрат электроэнергии.

3. Получение липидов (25 баллов). 1. Под липидами в данном случае подразумеваются растворимые в неполярных растворителях клеточные компоненты микроорганизмов. Их концентрация составляет до 75% сухой биомассы. В состав липидов микроорганизмов входит сравнительно много ненасыщенных жирных кислот. Так, в липидах плесневого гриба Penicillium soppii из жирных кислот содержатся пальмитиновая — 22%, стеариновая — 7,6%, олеиновая —45,2% и линолевая — 20% от общего их количества. Соотношение насыщенных и ненасыщенных кислот зависит не только от свойств продуцента, но и от условий культивирования. Низкая температура стимулирует синтез ненасыщенных жирных кислоту грибов. Общее количество и соотношение жирных кислот зависит и от присутствия К, Mg, Na и их соотношения в среде.

Синтез липидов стимулируют ингибиторы углеводного обмена, например арсенит натрия.

2.Для производства липидов микробного происхождения может быть использовано дешевое сырье, они в перспективе могут заменить жиры и масла растительного и животного происхождения, используемые для технических нужд. Таким дешевым исходным сырьем являются гидролизаты древесины или торфа, а также продукты нефти. Чтобы в клетках микроорганизмов накопилось максимальное количество липидов, во время ферментации надо лимитировать количество азота и вести ее в аэробных условиях. За сутки в биомассе дрожжей Rhodotorula gracilis может образоваться 50—60% липидов. Содержание белков в биомассе при таких условиях уменьшается до 10—20%. На синтез 1 г липидов расходуется 6 г сахара. В качестве примера можно привести культивирование дрожжей Lipomyces lipoferus на гидролизатах торфа, нейтрализованных известковым молоком до рН 6,0 и содержащих 1,5% РВ. К среде добавляют дополнительно КН2РО4— 0,1 г/л, MgS04 — 0,04 г/л и СаС12 —0,04 г/л. Содержание азота в гидролизате вполне достаточно для роста культуры. Динамика образования биомассы и липидов этой культурой в лабораторных условиях показана на рис. 44.

Содержание липидов в биомассе после 4—5 сут выращивания составляет 50% по сухому веществу. В их состав входят 5,0 — 6,0% фосфолипидов, 4,8 — 6,5% стеринов, 2,1 — 10,7% моно- и диглицеридов, 2,3—9,6% свободных жирных кислот, 70,7—75,1% триглицеридов и 1,7—2,1% эфиров стеринов и воска.

Липиды выделяют из биомассы экстракцией эфиром. Из 1 т сухого торфа можггЪ получить 40—50 кг липидов. По физико-химическим свойствам они близки к растительным маслам, которые используют во многих отраслях промышленности для технических нужд. Возможно отобрать такие культуры микроорганизмов и создать условия культивирования, чтобы в биомассе накапливалось меньше липидов (15—30%), но больше белков (30—40%)- В этом случае после экстракции липидов получают ценный кормовой препарат — микробный жмых. В последнее время доказано, что микроорганизмы могут выделять липиды из клеток в культуральную жидкость. Культура дрожжей Rhodotorula glutinis выделяет из клеток уксусную (40%), миристиновую (1%), пальмитиновую (14%), стеариновую (1,5%), олеиновую (29%), линолевую (3%), линоленовую (0,5%) и 3-дигидроксигексадекановую (8,5% ) кислоты (данные приведены в процентах к общей массе экстрацеллюлярных липидов). При культивировании Candida bogoriensis в среде образуются игольчатые кристаллы липидов с температурой плавления 74—76°С. Эти кристаллы состоят из углевода софорозы и гидроксигокозановой кислоты, соединенных гликозидной связью.

4. Выделение чистых культур бактерий (15 баллов). Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу —фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseudomonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур бактерий.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

№ 29 ЕМТИХАН БИЛЕТІ / ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ