3. Производства продуктов микробного синтеза второй фазы (25 баллов).

1. Производство продуктов микробного синтеза второй фазы. С использованием микроорганизмов получают витамины В1, В2 (продуценты— бактерии, грибы родов Candida, Pichia, Ashbya); фолиевую, пантотеновую кислоты, пиридоксаль, витамин В12 (продуценты — Propionibacteriumshermanii, Pseudomonasdenitrificam или метаногенные бактерии). Витамин С производят путём химического синтеза, однако этап высокоселективного дегидрирования D-сорбита в L-сорбозу осуществляют с помощью уксуснокислых бактерий.

Получение продуктов брожения. Брожение — это одна из разновидностей биологического окисления субстрата у гетеротрофных микробов в целях получения энергии, когда акцептором электронов или атомов водорода является органическое вещество.

Биотехнологические бродильные процессы изучены давно в сравнении, например, с биотехнологией антибиотиков, аминокислот и других продуктов. Однако некоторые брожения реализованы на практике относительно недавно, например, брожения с участием Zymomonas spp.

В основе многих бродильных процессов лежит универсальная реакция превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой промежуточный продукт (интермедиат) — пировиноградную кислоту, или пируват, из которого синтезируются различные конечные продукты. По метаболиту, образующемуся в наибольшем количестве, называют соответствующее брожение: спиртовое, масляно кислое, молочнокислое, и т. д.

Спиртовое брожение. Оно лежит в основе получения этилового спирта, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия. Возбудителями спиртового брожения могут быть дрожжи — сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus oryzae) и бактерии (Erwinia amylovora, Sarcina ventricula, Zymomonas mobilis, Z. anaerobia). Среди названных организмов дрожжи занимают ведущее место, а получение с их помощью этанола относят к разряду наикрупнейших в мире. Этанол используют в различных отраслях народного хозяйства: то как растворитель, то как сырье для химического синтеза, широко используют в медицине, и т. д.

Специальные штаммы Saccharomyces cerevisiae рекомендованы как биообъекты в производстве этанола (на африканском континете чаще применяют Schizosaccharomyces pombe и S. octosporus).

Штаммы подразделяют в свою очередь на расы верхового и низового брожений, а по способности к флокуляции — на хлопьевидные и пылевидные. Расами верхового брожения являются спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные дрожжи, расами низового брожения — большинство винных и пивных дрожжей.

Клетки обеих рас могут быть подвержены флокуляции. При этом следует помнить, что пылевидные дрожжи находятся в диспергированном состоянии в течение бродильного процесса. Они менее стойки к автолизу, но более полно сбраживают сусло; хлопьевидные — оседают на дно или всплывают на поверхность, они более выраженные ароматизаторы.

В отличие от S. cerevisiae аэротолерантные бактерии Z. Mobilis меньше чувствительны к этанолу, у них отсутствует катаболитная репрессия, а удельная скорость потребления глюкозы и образования этанола в 2—3 раза выше.

Катаболизм глюкозы протекает по Энтнеру-Дудорову. Однако скорость размножения этой бактерии низка и продуктивность по спирту не столь высока. Здесь остается резерв надежд на позитивные результаты генетико-селекционной работы с продуцентом.

Значительный интерес представляет S. rosei. Эти дрожжи способны образовывать этанол при использовании топинамбура (земляная груша), в котором из углеводов содержится преимущественно инулин, сбраживаемый после гидролиза до этанола. Топинамбур хорошо растет даже в северных регионах (Архангельская, Ленинградская и другие области) на бедных супесчаных почвах.

Ацетонобутиловое брожение. Углеводные источники (крахмал, патока, гидролизаты целлюлозы различного происхождения и др.), применяемые для дрожжей при спиртовом брожении, могут быть использованы при ацетонобутиловом брожении, протекающем в анаэробных условиях в процессе жизнедеятельности спорообразующих бактерий — Clostridium acetobutylicum. В результате образуются такие нейтральные продукты, как ацетон и бутанол, а также уксусная и масляные кислоты, диоксид углерода, водород. Нейтральные продукты представляют большой интерес для промышленного органического синтеза (эфиров для лакокрасочной промышленности), как экстрагенты и растворители, и т. д. Несмотря на то, что синтетические и биотехнологические процессы получения ацетона и бутанола являются конкурирующими, на практике реализуют оба вида производств, так как все зависит, главным образом, от стоимости сырья (экономические проблемы). Очевидно "сосуществование" синтетических и биологических технологий получения одних и тех же продуктов оправдано временем и жизнью общества.

Биосинтез ацетона и бутанола (в ФДФ-пути по Эмбдену-Мейергофу-Парнасу) существенно зависит от рН сред — при низких значениях активируются ферменты, участвующие в трансформации ацето-АцКоА в ацетон и, соответственно, больше расходуется НАД • Н для восстановления бутирил-КоА в бутанол. Уксусная и масляная кислоты выступают здесь в роли минорных компонентов, причем, первая из них может подвергаться конденсации до бутирата, который, в свою очередь, через бутирил-КоА превращается в бутанол (в незначительном количестве может образовываться этанол). Таким образом, бутанол и ацетон являются основными продуктами ацетонобутилового брожения.

Получение органических кислот. Прежде чем рассмотреть конкретные биотехнологические процессы получения органических кислот, необходимо оговориться, что под рубрику "брожения" должно быть отнесено образование в анаэробных условиях только молочной и пропионовой кислот с помощью соответствующих бактерий, тогда как биосинтез лимонной, глюконовой, итаконовой и некоторых других органических кислот определенными микромицетами представляет собой разновидность того или иного окислительного (аэробного) процесса и поэтому отнесение их к брожениям является условным.

Бродильные процессы получения органических кислот. Получение молочной кислоты. Образование молочной кислоты (СН3СНОНСООН) лактобактриями происходит в естественных условиях при скисании молока и молочных продуктов, а также при ее целенаправленном получении в производственных условиях.

Молочнокислые бактерии относят к 4 родам: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus и Pedicoccus. Род Lactobacillus включает 3 подрода — Thermobacterium, Streptobacterium и Betabacterium. Представители первого из них не растут при 15^оС, но могут выдерживать температуры выше 50^оС. Стрептобактерии не являются термофилами. Бетабактерии образуют DL-молочную кислоту из глюкозы. Одни из них (термобактерии, стрептобактерии, стрептококки и педикокки) являются гомоферментативными, образующими при сбраживании гексоз преимущественно молочную кислоту, другие (бетабактерии и лейконостоки) — гетероферментативными, образующими молочную и уксусную кислоты, диоксид углерода, возможно — этанол; молочнокислые бактерии могут использовать мальтозу, глюкозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр. В целом, лактобактерии — требовательны к питательным средам — многие из них нуждаются в ряде витаминов из группы

В, некоторых аминокислотах, пуринах и пиримидинах, отдельных органических кислотах алифатического ряда (уксусной, лимонной, олеиновой). Для сбраживания глюкозы и гидролизатов крахмала на практике применяют обычно Lactobacillus delbrueckii, L.bulgaricus, L. leichmanii (одни или в смеси между собой или со Streptococcus lactis), для сбраживания мальтозы иногда используют L. casei.

В промышленном производстве молочной кислоты обычно используют термофильные гомоферментативные виды, активно синтезирующие целевой продукт, например, при 50оС. Таким видом яляется L. delbrueckii штамм Л-3, отличающийся высокими стабильностью и активностью кислотообразования (выход молочной кислоты составляет 95—98% от потребленной сахарозы). Этот вид внедрен в промышленность еще в 1923 г. под руководством В. Н. Шапошникова.

Принципиальная технологическая схема получения L( + )-молочной кислоты состоит в следующем: мелассную среду, содержащую 5—20% сахара, вытяжку солодовых ростков, дрожжевой экстракт, витамины, аммония фосфат, засевают L. delbrueckii.

Брожение протекает при 49—50^оС при исходном рН 6,3—6,5. По мере образования молочной кислоты ее периодически нейтрализуют мелом. Весь цикл ферментации завершается за 5—10 дней; при этом в культуральной жидкости содержатся 11—14% лактата кальция и 0,1—0,5% сахарозы (80—90 г лактата образуются из 100 г сахарозы). Клетки бактерий и мел отделяют фильтрованием (отход), фильтрат упаривают до концентрации 30%, охлаждают до 25^оС и подают на кристаллизацию, которая длится 1,5—2 суток.

Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой при 60—70^оС, гипс выпадает в осадок, а к надосадочной жидкости добавляют желтую кровяную соль при 65^оС для удаления ионов железа, затем натрия сульфат для освобождения от тяжелых металлов. Красящие вещества удаляют с помощью активированного угля. После этого раствор молочной кислоты подвергают вакуум-упариванию (при остаточном давлении 800—920 кПа) до 50% или 80%. Оставшийся не до конца очищенный раствор молочной кислоты используют для технических целей. Более очищенную кислоту можно получать при перегонке ее сложных метиловых эфиров, при экстракции простым изопропиловым эфиром в противоточных насадочных колоннах.

Получение антимикробных веществ. К антимикробным средствам относят антисептики, дезинфектанты и химиотерапевтические вещества.

Антисептики — это химические вещества, неизбирательно и губительно действующие на микроорганизмы (в том числе — патогенные), находящиеся на поверхности тела и слизистых оболочек открытых полостей.

Дезинфектанты — это, в основном, антисептики, действие которых направлено на патогенные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней среды. Химиотерапевтические средства — это вещества синтетическогои природного происхождения, избирательно и губительно действующие на патогенные микробы, клетки злокачественных опухолей и гельминты.

Антисептики, дезинфектанты, неорганические и синтетические химиотерапевтические средства не имеют непосредственного отношения к биотехнологии. В то же время подавляющее большинство антибиотиков получают при ферментации микробов-продуцентов, или, в других случаях, применяют "антибиотическое ядро" для синтеза целевого продукта — полусинтетического антибиотика.

Известны единичные антибиотики (ранее получаемые с помощью биосинтеза или получаемые таким путем и ныне), которые в настоящее время производят на предприятиях органического синтеза (левомицетин и некоторые другие).

Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь относят к веществам природного, полусинтетического и, реже, синтетического происхождения, которые в малых концентрациях ингибируют рост (размножение) каких-либо микроорганизмов.

Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, по- лимиксина и др.), являются бациллы, других — актиномицеты (например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих — нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов, цефалоспоринов), четвертых—неспорообразующие бактерии (например, монобактамов).

Получение аминокислот. Аминокислоты играют большую роль в здравоохранении, животноводстве и легкой промышленности.

По значению для макроорганизма аминокислоты подразделяют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом и/или животном организме, они должны быть привнесены с пищей или кормом для животных.

Заменимые синтезируются in vivo из аммиака и различных источников углерода. Микроорганизмы сами синтезируют все необходимые им аминокислоты из аммиака и нитратов, а углеродные "скелеты" — из соответствующих интермедиатов.

Исходя из такой оценки аминокислот, ученые давно стремятся использовать способности микроорганизмов продуцировать заменимые и незаменимые аминокислоты в ощутимых количествах.

Потребность людей в аминокислотах достаточно велика и эти определяется уровень их производства в мире (порядка 500 тыс. тонн в год).

Специфические ферменты, регулирующие биосинтез аминокислот, широко распространены у бактерий; они с определенной глубиной изучены у Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis и пр. У грибов, в ответ на аминокислотное лимитирование, отмечается некоординированное, параллельное возрастание уровня ферментов, катализирующих реакции биосинтеза различных аминокислот. Этот "общий контроль биосинтеза аминокислот" был также назван "метаболическим интерблоком", или "перекрестнопутевой регуляцией", впервые выявленной у Neurospora crassa в 1965 г. М. Карсиотисом и сотрудниками, а позднее — у Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans и других грибов.

В гиперпродукции отдельных аминокислот культурами E.coli, Serratia marcescens и др. важную роль играют Feedback-ингибиция и Feedback-репрессия, например, при биосинтезе ароматических аминокислот на последних стадиях. Штаммы — суперпродуценты, эксплуатируемые в производстве, как правило, получены с использованием методов генетики и селекции.

Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов, то есть размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем — на жидкой среде в колбах, инокуляторах и посевных аппаратах, а затем в головных (основных) ферментаторах. Отработку культуральных жидкостей и выделение аминокислот проводят по схеме, аналогичной схеме получения антибиотиков (см.). Изолированные чистые кристаллы целевого продукта обычно высушивают под вакуумом и упаковывают.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии: ферментацию, стабилизацию аминокислоты в культуральной жидкости перед упариванием, вакуум-упаривание, стандартизацию упаренного раствора при добавлении наполнителя, высушивание и упаковку готового продукта, в котором должно содержаться не более 10% основного вещества. Например, в промышленности изготавливают сухой кормовой и жидкий кормовой концентраты лизина наряду с кристаллическим лизином.

Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный полиауксотрофный штамм — продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде.

В двухступенчатом способе микроб-продуцент культивируют в среде, где он получает и синтезирует все необходимые ингредиенты для последующего синтеза (в идиофазу) целевого продукта.

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, то после 1-й ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клетки.

Экономически целесообразными являются способы получения аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток.

Получение витаминов. Витамины поставляются в организм с пищей или их назначают в форме лекарственных препаратов при определенных патологических процессах. Среди липидо- и водорастворимых витаминов известны реализованные биотехнологические процессы производства витаминов А и D, рибофлавина, аскорбиновой кислоты, цианкобаламина (В12).

Аскорбиновая кислота, или витамин С — это противоцинготный витамин, имеющийся у.всех высших растений и животных; только человек и микробы не синтезируют ее, но людям она неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И, тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты — L-сорбозы. Таким образом, весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным.

Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвязанной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон — L-сорбозы, окисление диацетон — L-сорбозы до диацетон-2-кето-Е-гулоновой кислоты, подвергаемойзатем гидролизу с получением 2-кето-Ь-гулоновой кислоты; последнюю подвергают энолизации с последующей трасформацией в L-аскорбиновую кислоту.

Ферментацию G.oxydans проводят на средах, содержащих сорбит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной аэрации (8—10 г Ог/л/ч). Выход L-сорбозы может достичь 98% за одни-двое суток. При достижении культурой log-фазы можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25%. Также установлено, что Coxydans может окислять и более высокие концентрации полиспирта (30—50%), создаваемые на последних стадиях процесса. Это происходит благодаря полиолдегидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме.

Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ. Аскорбиновую кислоту используют как антиоксидант в здравоохранении и пищевой промышленности.