2.Культивироание микроорганизмов глубинным способом (30 баллов).

При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии.

В небольшую (50—250 мл) колбу наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру либо с поверхности косого агара, либо из ампул. Затем колбу на сутки или более помещают в термостат с определенной температурой, где культура растет и размножается. Чисто аэробные микроорганизмы выращивают в специальных колбах, которые ставят на качалку в термокамере. После этого культуру пересевают в лабораторные ферментаторы со средой такого же или несколько измененного состава. Лабораторные ферментаторы — стеклянные аппараты емкостью 1 —10 л, в которых можно обеспечить продувание среды воздухом, регуляцию температуры, рН и других условий роста. По описанной выше схеме обычно организуют исследование культур микроорганизмов. Кроме того, таким путем готовят и чистую культуру для производственных нужд. Дальнейшее размножение чистой культуры в производственных условиях идет в несколько стадий при использовании металлических инокуляторов объемом от 0,1 до 100 м3 и более. Инокуляторы снабжены мешалками, аэраторами, устройствами для стерилизации и охлаждения, арматурой, измерительными приборами. Для каждой следующей стадии необходимо 3—20% посевного материала (по объему).

Последнюю стадию, в которой получают нужный продукт, называют рабочей ферментацией. В культуральной жидкости, полученной после нее, суспендированы микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты. Методами химической технологии из культуральной жидкости получают биомассу или нужное вещество — спирт, кислоту, аминокислоту антибиотики и пр.

Аналогично выращиваются и анаэробные микроорганизмы, только в этом случае через питательную среду не продувают воздух.

Используя метод поверхностных культур, микроорганизмы выращивают на твердых средах (влажные отруби и др.) или на жидких средах, залитых тонким слоем (2—20 см) в специальные кюветы. В этом случае биомасса располагается на поверхности среды. Чаще всего этим методом выращивают грибы, например культуры рода Aspergillus, используемые для получения лимонной кислоты и ферментов. Сначала размножают споры, которыми инфицируют стерильную среду. В камерах с кюветами поддерживают нужную температуру и обеспечивают аэрацию — циркуляцию воздуха между кюветами.

3. Основные физико-химические факторы, влияющие на метаболические процессы микроорганизмов (25 баллов).

Существенное влияние на рост культуры и метаболические процессы оказывают факторы внешней среды, активизирующие или ингибирующие действие клеточных ферментов.

1). Состав и концентрация компонентов питательной среды обеспечивает метаболические реакции необходимыми субстратами. Недостаток вызывает лимитирование ферментов клетки субстратом. Избыток - субстратное насыщение и ингибирование роста в результате повышения осмотического давления.

2). Концентрация продуктов метаболизма – замедляет протекание биохимических реакций.

3). рН среды – важным условием нормальной жизнедеятельности микроорганизмов является поддержание постоянного значения внутриклеточного рН (для ацидофилов 6,0-7,0; алкалофилов 9,0-10,0; нейтралофилов 7,5). Значение рН оказывает существенное влияние на синтез того или иного метаболита. В ряде случаев оптимум для роста культуры и образования продукта неодинаков. С увеличением температуры культивирования диапозон переносимых значений рН сужается.

4). Температура – оказывает влияние на эффективность конверсии субстрата в клеточную массу, скорость роста, состав внутри- и внеклеточных метаболитов. Температурный режим предопределяет выбор микроорганизмом того или иного метаболического пути (Bacillus cereus: 30-32⁰C – гликолиз; 7-10^оС – пентозофосфатный путь). Снижение температуры менее оптимальной для роста культуры приводит к замедлению диффузии растворенных веществ через мембрану и понижению энзиматической активности. Температуры, превышающие оптимум роста, как правило, стимулируют продукцию метаболитов.

5). Осмотическое давление и активность воды. Увеличение концентрации растворенных веществ приводит к повышению осмотического давления. Метаболическая реакция микроорганизма на повышение осмотического давления может быть двух типов:

- транспорт соли через мембрану в цитоплазму;

- синтез в клетке органических веществ, повышающих осмотическое давление в цитоплазме.

Осморегуляторные механизмы могут вовлекать 5 групп веществ: неорганические ионы, аминокислоты, дисахариды, полиолы, бетаины.

Со значением осмотического давления связан показатель активности воды (отношение давления водяного пара раствора к давлению водяного пара чистого растворителя). Для большинства микроорганизмов границы жизнедеятельности определяются значениями а_w = 0,6-1,0/

6). Содержание растворенного кислорода – обеспечивает метаболические процессы аэробов, являясь акцептором ионов Н⁺; замедляет или полностью подавляет развитие анаэробов.

7). Содержание растворенного диоксида углерода – необходимо для метаболизма автотрофов, для гетеротрофов может как стимулировать, так и подавлять метаболические процессы.

8). Вязкость среды – определяет диффузию питательных веществ из объема среды к поверхности клетки.