4. Количественный учет микроорганизмов (15 баллов).

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по величине титра клеток.

Титр клеток (или фаговых частиц) - это количество клеток в единице объема.

Выбор метода для определения числа клеток зависит от

) цели исследования;

) свойств питательной среды или субстрата;

) особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

Существуют методы, позволяющие определять: 1) общее количество микроорганизмов в исследуемом материале; 2) только количество жизнеспособных клеток.

С другой стороны, методы количественного учета микроорганизмов могут быть разделены на прямые и косвенные:

) прямые методы - это методы прямого счета (микроскопические);

) косвенные - а) основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (методы оптические (нефелометрия, спектрофотометрия и т.д.); б) методы подсчета колоний (методы высева).

Методы прямого подсчетаклеток под микроскопом

используют для определения общего количества микроорганизмов в различных материалах. Это такие методы как подсчет в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах.

Преимущества использования методов прямого подсчета клеток:

- широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы;

эффективность такого подсчета, как правило, в 10 - 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом;

позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых, либо эти группы клеток по отдельности);

дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта;

производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.

Основное ограничениебольшинства методов данной группы - необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом.

Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток.Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.

Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Сущность метода подсчета количества клеток путем высева

заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония - потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода:

· При посеве на поверхность агара (метод Коха).

Проводят в три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.

· Метод посева в агаризованную среду

осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.

· Метод посева в тонком слое

агаризованной среды

предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 -3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды

все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные сред

ы колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.

№ 26 ЕМТИХАН БИЛЕТІ / ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ