Лабораторная работа №12 Количественное определение холестерина в сыворотке крови ферментативным методом

Принцип метода:

холестеринэстераза

1. Эфиры ХС ------------------------→ холестерин + жирные кислоты

холестериноксидаза

2. холестерин + О₂ + Н₂О -----------------------→ холестенон +Н₂О₂

пероксидаза

3. 2Н₂О₂ + 4-аминоантипирин + фенол ---→ окрашенное соединение + 4Н₂О

Реактивы: 1) рабочий реагент включает фосфатный буфер, натрий холевокислый, фенол, 4-аминоантипирин, холестериноксидазу, холестеринэстеразу, пероксидазу; 2) калибровочный раствор холестерина концентрацией 4,65 ммоль/л.

Ход работы:

Отмерить, мкл	Опытная проба	Калибровочная проба
Рабочий реагент	1000	1000
Сыворотка крови	100	−
Калибратор	−	100

Пробы перемешать, инкубировать 10 мин при температуре 37^оС. Определить оптическую плотность опытных и калибровочной проб против рабочего реагента при λ=500 (490 – 520) нм. Окраска стабильна в течение 60 мин.

Результаты: Д₁=

Д₂= Д_к=

содержание холестерина (ммоль/л) рассчитывают по формуле:

С = Д₁/Д_к х 4,65

С₁ =

С₂ =

Норма в сыворотке крови – менее 5,2 ммоль/л.

Выводы:

Количественное определение холестерина в сыворотке крови по модифицированному методу Златкис-Зака*

Принцип метода: содержащийся в плазме или сыворотке крови свободный и эфирносвязанный холестерин окисляется хлорным железом в присутствии концентрированной серной и ортофосфорной кислот с образованием ненасыщенных продуктов, окрашенных в красно-фиолетовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина (присутствие следов воды мешает развитию окраски !).

Реактивы и оборудование: 1) Реактив для цветной реакции:

● основной раствор красителя (2,5 г хлорного железа растворить в 100 мл ортофосфорной кислоты), ● рабочий раствор красителя (8,0 мл основного раствора развести до 100 мл концентрированной серной

кислотой); 2) этанол; 3) калибровочный раствор холестерина в этаноле,

содержащий 1,6 мг/мл (3 ммоль/л); 4) штатив с химическими пробирками (сухими!); 5) микропипетка для взятия сыворотки на 0,1 мл; 6) пипетка на 2 мл; мерная центрифужная пробирка для отмеривания реактива для цветной реакции; 8) фотоэлектроколориметр.

Ход работы: в пробирку прибавляют микропипеткой 0,1 мл сыворотки крови, добавляют 1,4 мл этанола. Осторожно по стенке пробирки добавляют 2,0 мл реактива для цветной реакции, пробу хорошо встряхивают (но осторожно, направляя при этом отверстие пробирки от себя и окружающих), оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Развивается красно-фиолетовая окраска. Полученный окрашенный раствор колориметрируют на ФЭКе, против реактивов без добавления сыворотки крови. Светофильтр зеленый (λмакс.= 540 нм). Расчет концентрации холестерина проводится с помощью калибровочной кривой.

Результаты: Д₁= С₁=

Д₂= С₂=

содержание холестерина рассчитывают по формуле

Х = С × 100/0,1 = мг% × 0,0258 = ммоль/л, где

0,1 - количество мл сыворотки, взятое на исследование

С - количество холестерина в крови в мг, найденное по калибровочному графику после определения оптической плотности пробы (Д).

Норма содержания холестерина в сыворотке крови 3,6-6,4 ммоль/л.