Техніка, що використовується для первинного культивування клітин та тканин

Зараз існує дуже багато різноманітних варіантів техніки культивування клітин. Один з найпростіших методів полягає у розміщенні маленьких шматочків тканини у згусток на покривному склі, закритому предметним склом з лункою і закритому парафіном. Ця техніка дуже проста і зручна для короткочасних експериментів, у тому числі для ряду культур маленьких шматочків тканин. При використанні стимулюючого ріст середовища і при частих пересівах такі культури можуть зберігатися на протязі багатьох генерацій. Однак при цьому важко зберігати культури в стані повільного розвитку, оскільки це потребує частої зміни середовища без пошкодження тканини. Для підтримання життєдіяльності тканин без пересіву на протязі довгого часу був розроблений метод з використанням подвійного покривного скла. Ця техніка має недолік, що не дозволяє використовувати її при деяких оптичних системах, тому є багато модифікацій, спеціальні фазові та перфоровані скляні або металеві платівки, які дають можливість проводити дослідження за допомогою фазовоконтрастної або інтерферентної мікроскопії.

Для культур органів була розроблена спеціальна техніка з використанням годинникових скелець, на яких тканина росте у згустку. При цьому годинникове скельце розміщують в чашку Петрі з мокрою ватою для підтримання необхідної вологості. Інша методика культивування органів розвилася на основі попередньо описаної, головним чином з використанням “плотика” з спеціального паперу, який не промокає, на якому вирощується тканина.

Звичайні пробірки є зручними для культивування великої кількості культур, коли немає необхідності у хороших оптичних умовах. Внаслідок цього вони можуть бути використані при вирощуванні тканин для вірусологічних та біохімічних досліджень. Пробірки з культурами можна обертати, або розміщувати у нерухомих штативах.

Якщо є необхідність в одночасному вирощуванні великої кількості культур для подальшого морфологічного дослідження, особливо зручним є застосування рухомих покровних скелець.

Культури готують на вузьких покривних скельцях і розміщують у пробірки, які обертаються. Культури на покривних скельцях звичайно готують для фотографування або кінозйомки.

Для культивування клітин протягом певного часу широко використовуються так звані флакони Карреля. Їх застосовують майже виключно на початку культивування. Використовуються і інші види посуду, головним чином для вирощування великих кількостей клітин. Спеціально з цією метою був запропонований Т-образний флакон Ерла з дуже рівними внутрішніми стінками, які мають добрі оптичні властивості. Часто також для вирощування клітин використовуються звичайні ерленмейєровські колби та матраци, що використовуються при виробництві пеніциліну.

Стандартним матеріалом багаторазового використання для вирощування тваринних клітин є скло, хоча у більш крупних культуральних посудинах воно замінюється на нержавіючу сталь. Більш доцільно використовувати алюмо-боросилікатне скло (наприклад, пірекс), так як воно вилужується слабше, ніж натрієве скло і у такий спосіб менше підлужує середовище. У випадку використання натрієвого скла його рекомендується детоксикувати шляхом кип’ятіння у слабкій кислоті. Скляний посуд повинен бути чисто вимитим і принаймні тричі ополоснути дистильованою водою. Клітини легко прикріплюються до скла, але прикріплення може бути підсиленим при різних обробках поверхні. Але в суспензійній культурі прикріплення клітин є небажаним; для попередження цього явища поверхні культуральних посудин обробляються силіконовими препаратами. При повторному використанні скляний посуд стає менш придатним для прикріплення клітин, але ефективність прикріплення може бути відновленою за допомогою обробки ацетатом магнію.

Для забезпечення стерильності, яка є однією з особливо жорстоко контрольованих умов, в останній час практикується використання стерильного пластикового посуду (флаконів, чашок, піпеток) разового використання. Так поділ деяких типів клітин у культурі відбувається лише тоді, коли вони є прикріпленими до субстрату. У цьому випадку матеріал посуду піддають спеціальній обробці при підготовці до культивування. Пластиковим матеріалом, що найбільш часто використовується для культур клітин, є полістирол, але використовують також поліетилен, полікарбонат, полівінілхлорид, тефлон, целофан та ацетат целюлози за умови правильної обробки цих полімерів.

Для росту клітин підходять також нержавіюча сталь та титан, оскільки обидві речовини хімічно відносно інертні і володіють достатньо високим від’ємним поверхневим зарядом. Існує багато марок нержавіючої сталі, і тому вибирають такі сорти, що не вивільняють у середовище токсичні іони металів. Нержавіюча сталь повинна бути промита кислотою (суміш 10% азотної кислоти, 3,5% фтористоводневої кислоти та 86,5% води) для видалення поверхневих забруднень і включень, що утворюються при обрізанні листа сталі.

Існують різний спеціальний посуд, який дозволяє довгий час спостерігати за клітинами під час росту за допомогою цейттраферної кінозйомки і одночасно проводити зміну середовища.

Маніпуляції з культурами проводять в боксах мікробіологічного типу, опромінених перед роботою ультрафіолетовим світлом або в ламінар-боксах, де асептика досягається постійною подачею стерильного повітря в робочому об’ємі.