Адгезія клітин до субстрату і біоматрикс

Загалом клітинні культур ссавців за рядом фізіологічних ознак поділяються на субстратзалежні моношарові і суспензійні. До перших відносять первинні клітини і лінії диплоїдних клітин, необхідною умовою життєдіяльності яких є наявність адекватної ростової поверхні для прикріплення. До других відносять трансформовані клітини і клітини крові, що мають здатність до синтезу і росту при знаходженні в монодисперсному стані. Вказана відмінність лежить в основі двох основних способів культивування: поверхневого, при якому обов'язковою є наявність ростової поверхні для прикріплення, і суспензійного, який ґрунтується на використанні монодисперсних клітин, що знаходяться в зваженому стані в об’ємі поживного середовища.

Більшість культур клітин, які використовуються у біотехнології медичних чи ветеринарних препаратів, є поверхневозалежними, тобто такими, проліферація яких можлива лише за умови прикріплення до біоафінної поверхні росту. До переваг використання поверхневозалежних культур відносять такі їх властивості, як спрощення стадій відмивання іммобілізованих шарів клітин та заміни середовища культивування (у порівнянні з суспензійними культурами), зменшення витрат часу, пошкоджуваності клітин при інтенсифікації масообміну та ризику контамінації культури при операціях заміни поживного середовища.

Для проліферації більшості типів нетрансформованих клітин необхідним є їх попереднє прикріплення до твердого субстрату. Взаємодія таких клітин зі своїм оточенням визначає багато клітинних властивостей. Крім кровотворних клітин, тільки трансформовані клітини здатні розмножуватися без прикріплення до субстрату. Саме тому життєздатність та активність проліферації поверхневозалежних клітин тварин залежить від можливості їх прикріплення до поверхні росту. У стандартних середовищах культивування, навіть за наявності містячої фактори росту сироватки, поверхневозалежні клітини, що залишаються у суспензії (наприклад при постійному перемішуванні) не ростуть і з часом гинуть.

У свою чергу, прикріплення та розпластування клітин тварин на твердих поверхнях залежить від хімічної та фізичної природи поверхні носія. Слід підкреслити, що поверхні клітин тварин, як і поверхні традиційних культуральних посудин із скла та пластика несуть від’ємні заряди. Тому для прикріплення клітин необхідним є утворення поперечних зшивок з глікопротеїнами, а також присутність двохвалентних катіонів Ca²⁺ та Mg²⁺. Найбільш вивченим з таких глікопротеїдів є фібронектин. Він має молекулярну масу 220000 Да, синтезується багатьма клітинами і присутній у сироватці та інших фізіологічних рідинах. І хоча клітини здатні прикріплюватися за рахунок одних тільки електростатичних взаємодій, було показано, що механізм прикріплення є одним і тим же при всіх зарядах субстрату. Важливим фактором є сумарний від’ємний заряд, і субстрати, що мають високу поверхневу енергію, виявляються досить придатними для прикріплення клітин. Отже, клітини тварин здатні прикріплюватися не до всіх типів твердих поверхонь. Зазвичай, найкращими поверхнями є гідролізовані (змочувані) поверхні з найменшою кривизною і від’ємний заряд. Підходящими субстратами для адгезії клітин можуть слугувати поверхні скла або спеціально оброблених пластикових матеріалів – так звані пластики для культури тканин з модифікованим поверхневим зарядом. Цього можна досягти як хімічною обробкою (наприклад, окислюючими агентами, сильними кислотами), так і в результаті фізичних впливів (високовольтний розряд, опромінення ультрафіолетовим світлом, бомбардування електронами високих енергій). Ці методи використовуються фірмами, що виробляють пластиковий посуд для культур. В результаті таких обробок збільшується загальний від’ємний заряд поверхні (наприклад, за рахунок утворення від’ємно заряджених карбоксильних груп), що полегшує електростатичне приєднання клітин.

В ході вивчення прикріплення клітин до твердих поверхонь досліджували механізми впливу гідрофільності на цей процес. Виявилося, що змочування впливає на адсорбцію білків на поверхні субстрату, а ступінь гідрофілізації поверхні визначає наявність негативно заряджених груп. До цих груп належать карбонільні та пероксидні групи, що мають здатність зв’язуватися з субстрат-адгезивними молекулами та факторами адгезії (останні є так званими адгезивними факторами росту). Джерелом субстрат-адгезивних молекул є сироватка тварин, яку додають до поживного середовища. Родина субстрат-адгезивних молекул налічує понад 30 молекул, серед яких найбільш відомі, окрім згаданого вище фібронектину, також колаген, ламініл, вітронектин та інші, якими часто покривають пластик для культивування поверхневозалежних клітин.

Для культивування поверхневозалежних культур клітин гідрофобні поверхні потрібно спочатку модифікувати, перетворюючи їх на гідрофільні. Це можна здійснити шляхом хімічного окислення полімерів посуду у концентрованих кислотах, або їз застосуванням такої технології фізичного окислення, як обробка електричним розрядом. При цьому механізм гідрофілізації гідрофобної поверхні полімерів полягає у порушенні структури його поверхні, внаслідок чого утворюються гідрофільні залишки.

Щодо розмірів, форми та характеристики поверхонь носіїв, які використовуються для культивування поверхневозалежних культур клітин, то було доведено, що клітини будуть витягуватися у напрямку найменшої кривизни субстрату, а довжина поверхні росту повинна бути більшою за довжину клітини у розпластаному стані. Окрім того, на поверхнях різних форм клітини матимуть різну довжину. Це потрібно мати на увазі під час прийняття рішень щодо розмірів носіїв, особливо коли їх поверхня текстурована. Найкращою ж поверхнею для культивування поверхневозалежних культур клітин є рівна (без заглибин) гідрофільна поверхня їз адсорбованим на ній шаром адгезивних білків.

Для росту і диференцировки деяких клітин, особливо епітеліальних клітин та нейронів, найбільш придатним субстратом виявився колаген. Колаген є головним компонентом позаклітинного матриксу, до якого прикріплюються клітини. Клітини зв’язуються з субстратом не безпосередньо, а за участі факторів адгезії. Найбільш розповсюдженим і добре вивченим фактором адгезії є фібронектин – білок, який міститься у плазмі та сироватці. Фібронектин зв’язується з різними субстратами, а клітини прикріплюються до цього фактору за допомогою специфічних рецепторів фібронектину. Показано, що зв’язуюча здатність фібронектину обумовлена тетрапептидом Arg-Gly-Asp-Ser, що є частиною домена, який контактує з клітинами. Відомі і інші фактори адгезії, такі як хондронектин та ламінін, останній бере участь у адгезії епітеліальних клітин. Деякі типи клітин здатні синтезувати колаген, ламінін, глікозаміноглікани і глікопротеїни in vitro, формуючи у такий спосіб власний позаклітинний матрикс. Позаклітинний матрикс у формі біоматриксу може бути виділений з різних тканин і доданий до культуральних флаконів або чашок.

Субстрат відіграє важливу роль у підтримці нормальних клітинних функцій. Ізольовані гепатоцити виживають на пластику на протязі лише одного тижня, тоді як на колагені вони можуть зберігати життєздатність до місяця. На біоматриксі гепатоцити можуть виживати на протязі 6 місяців і більш. При культивуванні клітин на пластику виявляється їх тенденція до дедиференціювання, що проявляється у зміні морфології. Так епітеліальні клітини в цих умовах набувають фібробластоподібну форму і починають синтезувати білки, специфічні для фібробластів. Культивування клітин на колагені або біоматриксі підтримує початкову диференцировку і знижує необхідність додавання різних ростових факторів або сироватки.

Як відмічалося вище активність проліферації культури клітин визначається наявністю у середовищі культивування факторів росту: поліпептидних факторів росту, гормонів та компонентів екстрацеллюлярного матриксу. Регуляція проліферації здійснюється шляхом зв’язування вказаних агентів з поверхневими рецепторами клітини (трансмембранними рецепторами). Рецептори клітини, у свою чергу, поєднані з цитоскелетом, який пронизує всю клітину та визначає форму клітини, утримує її органели, впливає на стабільність відповідних мРНК та транскрипцію відповідних генів, тобто є головним регулятором проліферації клітини. Отже, середовище культивування культур клітин тварин in vitro повинно містити відповідні сигнали проліферації.

Динамічні властивості культивованих клітин часто важко контролювати, а деякі клітинні взаємодії, що спостерігаються in vivo, буває важко відтворити в умовах in vitro. У зв’язку з цим у деяких випадках, відмовляючись від серійного розмноження клітин, використовують клітинні системи, що зберігають структурну цілісність вихідної тканини. Такі системи отримали назву гістіотипових, або органних культур. Робляться також спроби відтворення тканиноподібних структур in vitro шляхом реагрегації різних типів клітин та їх культивування при високій щільності у формі сфероїдів, перфузованої багатошарової культури на пластиковому або скляному субстраті, або культивування на мікроносіях, таких як колагенові волокна та синтетичні мікропористі фільтри.