Підготовка до заморожування

Для заморожування слід відбирати культури на пізній логарифмічній фазі росту, оскільки саме у таких культурах клітини є найбільш життєздатними. За необхідності культуру обробляють трипсином для отримання однорідної суспензії поодиноких клітин, як і у випадку звичайного пересіву, і далі проводять такі операції:

1. Безпосередньо перед використанням готують середовище для заморозки шляхом простого змішування свіжого ростового середовища з вибраним кріопротектором. Концентрація кріопротектора мало залежить від типу клітин і природи кріопротектора, і зазвичай використовується в діапазоні від 5 до 10% по об’єму.

2. Клітини осаджують центрифугуванням і ресуспендують осад у потрібному об’ємі середовища для заморозки при кімнатній температурі. Найбільш зручно доводити концентрацію клітин до 10⁶ – 10⁷ клітин/мл, але у деяких випадках цю величину на порядок зменшують або збільшують.

3. Якщо загальний об’єм суспензії є великим, клітини підтримують у стані суспензії м’яким перемішуванням у підходящому сосуді. На протязі всього процесу постійно струшують суспензію.

4. При необхідності підтримують рН суспензії, пропускаючи крізь неї суміш водонасиченого повітря з СО₂.

5. Розливають клітинну суспензію (по 1 мл) по ампулах. Щоб в ампулах була суспензія однакової щільності, необхідно проводити розлив швидко і ритмічно.

6. Запаюють кожну ампулу, розміщують їх у спеціальному підтримувачі або ж на якомусь лотку і повністю занурюють у у водний розчин метиленової синьки (0,05%) при 4⁰С. Через 30-45 хв. Ампули видаляють, промивають холодною водопровідною водою і викидають ампули, до яких потрапив барвник.

7. Ретельно висушують ампули і починають повільне заморожування.

8. Коли температура ампул досягне -50 - -70⁰С і нижче, ампули виймають з охолоджуючого пристрою і швидко переносять до рефрижиратору з рідким азотом.

Розморожування і оцінка виходу клітин

Для оптимального відновлення життєздатності клітин необхідна висока швидкість їх розморожування. Для цьог, надівши маску, виймають потрібні ампули з рефрижиратору і швидко поміщають їх у теплу водяну баню (37⁰С). Якщо ампули зберігалися у рідкому азоті, а не у його парах, кожну ампулу розморожують окремо, поміщуючи її під шар води товщиною біля 10 см при 37⁰С. При цьому ампули струщують, поки суспензія повністю не розтане. Далі ампули занурюють у 70% етанол при кімнатній температурі. Надпилюють ампули пилочкою, попередньо обробленою етанолом., після чого ампули відкривають і вміст переносять до культурального посуду і додають 10 мл повного ростового середовища. Далі починається стандартне культивування клітин.

Для оцінки виходу клітин після заморожування можна використовувати багато методів. Зрозуміло, що це лише перший етап оцінки якості клітин, що здійснюється після зберігання.

Виключення барвника для визначення життєздатності клітин. Досить приблизна оцінка життєздатності клітин у суспензії може бути отримана за допомогою тесту на виключення барвника. Цей тест заснований на тому, що живі клітини не можуть захоплювати деякі барвники, тоді як мертві клітини проникнені для них. Найбільш відомими барвниками такого роду є трипановий синій та еритрозин В (0,4% розчини). Підрахунок забарвлених та незабарвлених клітин проводять стандартним способом у гемоцитометрі (камері Горяєва). Непрямі виміри життєздатності клітин засновані на життєздатності їх метаболічної активності. Параметром, що найбільш часто використовується для цього, є утилізація глюкози. У якості інших параметрів можуть бути також використані поглинання кисню, утворення молочної та піровиноградної кислот, і, крім того, експресія ферментів. При логарифмічному рості клітин спостерігається дуже тісна кореляція між утилізацією поживних речовин та числом клітин. Однак на інших фазах росту культури висока швидкість обміну, пов’язана не з ростом клітин, а з їх життєдіяльністю, може привести до отримання помилкових результатів.

Загальну клітинну масу в ростучій культурі визначають за сухою масою або кількістю білка.

Ефективність клонування. Тест на виключення барвника звичайно дає завищену оцінку життєздатності клітин. Для ліній клітин, що прикріплюються, більш точна оцінка життєздатності може бути отримана шляхом аналізу ефективності клонування розморожених клітин. При цьому слід пам’ятати, що на отриманому результаті відіб’ються вид ростового середовища, вибір субстрату, на якому будуть клоновані клітини, час інкубації. Тому при порівнянні різних препаратів заморожених клітин однієї лінії слід стандартизувати умови тестування. Аналізу ефективності клонування розморожених клітин здійснюється таким чином:

1. Об’єднують вміст розморожених ампул (приблизно 5% від усієї партії) і проводять серійне розбавлення культури для отримання для отримання суспензій 10²-10⁴ клітин/культура у залежності від ліній клітин, розміру культуральної поверхні і результату, що очікується. Так, клітини з високою ефективністю клонування висівають на чашки діаметром 9 см по 10 клітин, 100 клітин, 1000 клітин та 10000 клітин.

2. Проводять серійне 10-разове розбавлення клітин на кожному етапі шляхом переносу 1 мл суспензії у 9 мл повного ростового середовища.

3. По 1 мл отриманих розведень, починаючи від самих низьких концентрацій, розливають у кожний з трьох сосудів, що містять по 8 мл культурального середовища, і інкубують при 37⁰С.

4. Змінюють середовище в отриманих культурах на четвертий або п’ятий день і далі міняють середовище кожний третій або четвертий день.

5. Після 12-14 діб культивування зливають середовище і фіксують клітини 10% розчином формальдегіду або іншим фіксатором.

6. Вилучають фіксатор, ополіскують клітини декількома змінами водопровідної води і фарбують 1% водним розчином толуїдинового синього або іншим простим барвником на протязі 1-5 хв.

7. Видаляють барвник, змивають розчин, що залишився водопровідною водою і далі за допомогою лупи підраховують клони, що містять 16 та більше клітин.

8. Підраховують ефективність клонування по формулі: число клонів/число посіяних клітин100%.