Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
О.В. КАРПОВ-БІОТЕХНОЛОГІЯ КУЛЬТУР РОСЛИН І ТВАР...doc
Скачиваний:
7
Добавлен:
19.08.2019
Размер:
534.02 Кб
Скачать
  1. Клітини нерухомі, середовище перемішується (наприклад, реактор зі скляним намистом);

  2. Гетерогенне перемішування (наприклад, реактор зі стопою пластин);

  3. Гомогенне перемішування (наприклад, мікроносії).

Використання для вирощування клітин підкладки зі скляного намиста діаметром 3-5 мм, крізь яку протікає середовище, широко розповсюдилося починаючи з 1962 р. Намисто діаметром 3 мм розташовують достатньо щільно, щоб запобігти зміщенню упакованого намиста; при цьому суттєвим є забезпечення протікання середовища крізь колонку з такою швидкістю, яка не викликає механічного пошкодження клітин. Середовище звичайно переміщується за допомогою перистальтичного насоса, але може також бути використаний повітряний ліфт, що забезпечує кращу оксигенацію. Середовище до колонки може потрапляти як зверху, так і знизу, що не впливає на результати культивування.

Гетерогенний реактор. Цей метод культивування заснований на тому ж принципі, що і дискова культура поверхнево-залежних клітин. Круглі пластини зі скла або нержавіючої сталі встановлюються вертикально на центральному стрижні на відстані 5-7 мм один від одного. Цей стрижень може бути нерухомим, тоді для перемішування використовують повітряний ліфт. Інший варіант полягає у обертанні стрижня навкруги вертикальної (6 обертів/годину) або горизонтальної (50-100 обертів/хвилину) вісі. Головним недоліком цього типу культивування є високе відношення об’єму середовища до робочої поверхні. Досягти суттєвого покращення цього параметру не вдається і при переході до системи з горизонтальними дисками, хоча у останньому випадку відношення виявляється вдвічі нижчим, ніж у системі з дисками, що обертаються вертикально.

Альтернативним способом культивування клітин, що вдало поєднує у собі елементи поверхневих і суспензійних процесів, є культивування іммобілізованих клітин, зокрема на мікроносіях. Мікроносії (скло, сефадекс, біосилан, цитодекс тощо) являють собою сферичні частки розміром 115-200 мкм, площа поверхні яких складає близько 4600-6000 см2/мл. На мікроносіях можливе культивування клітин при концентрації носія 1-5 г/100 мл середовища і щільності 4×106 клітин/мл в об’ємі до 150 л Культивування на мікроносіях відноситься до гомогенних процесів, при яких використовують, найчастіше, ті ж процеси й апарати, що і при звичайному суспензійному культивуванні. При здійсненні відкритого культивування для затримки іммобілізованих на мікроносіях клітин використовують системи із седиментацією або утриманням клітин методами фільтрації.

Особливо детально слід зупинитися на використанні гомогенних систем (мікроносіїв), зважуючи на безсумнівну перспективність таких систем. Коли клітини ростуть на дрібних сферичних носіях, вони, будучи по суті поверхнево залежними, можуть розглядатися як суспензійні, і для їх вирощування можуть застосовуватися процеси і апаратура, розроблені для суспензійних культур. Стандартні сосуди з перемішуючим циліндром є непридатними для цього типу культур без модифікації системи перемішування. Необхідні мішалки з великою площею поверхні лопатей. Культура з мікроносіями перемішується дуже повільно (менш ніж 75 обертів/хвилину), при цьому не можна використовувати перемішуючі механізми, у яких рухомі поверхні торкаються одна одну у середовищі – це може привести до руйнування мікроносіїв. Оскільки перемішування, а таким чином і переміщення маси у таких культурах досить слабке, глибина середовища не повинна перевищувати діаметр посудини більш ніж у два рази, якщо тільки не передбачена система оксигенування або регулярна зміна середовища. При посіві культури з мікроносіями критичними виявляються багато фізіологічних факторів. Так мікроносії мають сферичну форму, а клітини завжди прикріплюються до ділянок з мінімальною кривизною. Хоча поверхня мікроносіїв не може бути ідеальною, але вона зобов’язана бути підходящою за своїми фізичними та хімічними властивостями. Тому при посіві такої культури, спочатку переконавшись, що середовище та гранули знаходяться при оптимальних рН та температурі, вносять клітини (з логарифмічної, але не зі стаціонарної фази культури) в об’ємі середовища, що складає третину кінцевого об’єму. Це збільшує вірогідність контакту клітини з мікроносієм. Кінцева концентрація мікроносіїв повинна складати 2-3 г/л, а більш високі концентрації потребують підвищеного контролю умов культивування та дуже частих змін середовища. Спочатку становлення цього методу зв’язування клітин з мікроносіями проводили в стаціонарній культурі, перемішуючи її кожні 30 хв на протязі 30 сек. Це, однак, приводило до нерівномірного розподілу клітин між гранулами мікроносія, і зараз різке покращення якості мікроносіїв дозволяє починати перемішування негайно при мінімально можливій швидкості (10-25 обертів/хвилину), забезпечуючи повне перемішування.

По завершенні прикріплення (3-8 годин) об’єм культури повільно доводять до робочого, і швидкість перемішування збільшується для підтримки повністю гомогенної суміші. При виконанні цих умов і за відсутності зміни температури та рН можлива ініціація росту культури на мікроносіях для всіх клітин, здатних рости на пластикових поверхнях.

Аналіз росту клітин в культурі на мікроносіях не являє ніякої проблеми. Легко проводиться відбір проб, визначається число клітин, концентрація глюкози та досліджується морфологія клітин. По мірі росту клітин гранули носія стають важчими що потребує збільшення швидкості обертання.

Збір клітин з носіїв у випадках багатьох клітинних ліній виявляється досить складною задачею, якщо клітини не досягли високої щільності на гранулах. На жаль, багатошаровий ріст ріст клітин на мікроносіях відбувається надзвичайно рідко. Збір клітин починається з видалення середовища, одноразової промивки гранул з клітинами буфером та суспендування мікроносіїв з клітинами у розчині відповідного ферменту. Культура потім перемішується при високій швидкості (75-125 об/хв) на протязі 20-30 хв. Якщо клітини відкріпляться, то значна їх частина може бути зібрана, якщо дати гранулам осісти на протязі 2 хвилин і потім декантувати супернатант. Для більш повного відбору суміш переноситься у скляний фільтр з крупними порами. Клітини проходитимуть крізь фільтр, а гранули мікроносія затримаються на ньому.

Збільшення масштабу культур на мікроносіях може бути досягнуто а) збільшенням концентрації мікроносіїв і б) збільшенням розміру культур.

При відкритому способі культивування суспензійних клітин використовується, як правило, система, що складається з двох частин. В одній з цих частин знаходиться сифонний пристрій, що забезпечує гомогенізацію суспензії, у другий – вирощені клітини відокремлюються від середовища шляхом седиментації.

Дробний спосіб культивування в лабораторній системі здійснюється шляхом фільтрації збідненого середовища крізь фільтруючий пристрій, встановлений у біореакторі. Останній, крім фільтрування, виконує функцію перемішування культуральної рідини.

На думку багатьох дослідників найбільш перспективними системами суспензійного культивування клітин є мембранні біореактори. У таких реакторах поряд з ультра- і мікрофільтраційними мембранами, використовуються пристрої для культивування клітин на порожнинних волокнах, де такі волокна із селективно проникними стінками розміщені у формі джгута і поміщені в оболонку Клітини культивуються в порожнині, що знаходиться між джгутом волокон і зовнішньою оболонкою, а також безпосередньо між волокнами. В цьому випадку поживне середовище, збагачене киснем, подається шляхом прокачування уздовж волокон.

При культивуванні клітин на мембранах використовуються досить складні системи, у яких забезпечення клітин поживним середовищем і аерування засноване на явищі діалізу. Перевага таких систем полягає у кращому забезпеченні життєдіяльності клітин, а це, у свою чергу, дозволяє досягти щільності культивованих клітин до рівня 1010 кл/мл і при цьому проводити процес культивування протягом 17 діб.

Здійснюється культивування інкапсульованих клітин всередині сферичних полісахаридних мікрокапсул, до яких можуть потрапляти компоненти поживного середовища з молекулярною масою до 3000 Da. Клітини всередині таких мікрокапсул зберігають свою життєздатність, функціональну активність і здатність до метаболізму. Розроблено спосіб мікрокапсулювання "чуттєвих" клітин у полілізинові сфери, пори яких дозволяють проникати до клітин поживним речовинам і у той же час затримують високомолекулярні клітинні метаболіти.