Заморожування клітин і оцінка виходу

Пошкодження клітин, що відбувається при заморожуванні і відтаюванні культури, обумовлені, вірогідно, внутрішньоклітинними кристалами льоду та осмотичними ефектами. Додання кріопротекторів, таких як диметилсульфоксид (ДМСО) і гліцерин, а також підбір оптимальних швидкостей заморожування і відтаювання зводять пошкодження клітин до мінімуму.

Допустиме короткочасне зберігання заморожених клітин у шафі глибокого охолодження (-75⁰С), однак значно краще зберігати клітини у рідкому азоті (-196⁰С) або у його парах (-120⁰С). Метод заморожування у рідкому азоті є більш бажаним не тільки внаслідок більш низької температури, і, таким чином, майже необмеженого строку зберігання, але і внаслідок повної відсутності ризику механічного пошкодження клітин.

Існують дві проблеми техніки безпеки, пов’язані з роботою з клітинними лініями. По-перше, піддаються ризику співробітники, що розморожують ампули – рідкий азот може потрапляти до ампул крізь мікротріщини, що утворюються при зберіганні. При розморожуванні швидке випарювання азоту всередині ампули може приводити до її вибуху і розлітанню уламків скла. Тому вилучення ампул з азоту повинне здійснюватися у захисній масці. По-друге, ДМСО може розчиняти органічні речовини і завдяки проникненню крізь гуму і шкіру переносити їх у кров. Тому при роботі з ДМСО слід дотримуватися особливих мір безпеки, щоб запобігти потраплянню в ДМСО шкідливих хімічних речовин і звести до мінімуму його контакт зі шкірою.

Обладнання

Ампули, маркування та пристрої для запаювання. Питання щодо використання скляних або пластикових ампул слід вирішувати, виходячи з масштабів заморозки та призначення заморожених клітин. Стерильні скляні ампули заповнюють суспензією клітин і міцно запаюють у відносно великих кількостях. Такі ампули рекомендуються для відносно великих партій клітин, призначених для довгого використання та подальшого розподілу. Менша кількість пластмасових ампул, більш зручних у користуванні, ніж скляні, простіше маркувати та закривати. У деяких випадках можуть виникнути проблеми з запаюванням, особливо у випадках необхідності частого сортування матеріалу або підготовки його для відправки до інших організацій.

Маркування ампул потребує спеціальної уваги, оскільки чіткість надписів може зникати під час заморожування ампул, відкривання та зачинення боксу з ампулами, їх переносу між холодильниками або контейнерами для перевозки і т.і. Використання паперових ярликів, кулькових ручок та стандартних лабораторних маркерів є небажаним, особливо у випадку скляних ампул. Надписувати можна від руки ручкою з пером, а у випадку крупних партій використовують спеціальний механічний відмітчик.

Запаювати ампули рекомендується шляхом відтягування їх шийок коли вони обертаються у найбільш гарячій зоні полум’я від газово-кисневої горілки. Техніка запаювання відтягуванням вважається більш надійною, оскільки у цьому випадку знижується ризик утворення капілярних каналів у запаяному кінчику. Для запаювання великих партій ампул горілку приєднують до спеціального напівавтоматичного пристрою для запаювання.

Апарати для повільного заморожування. Оптимальна швидкість заморожування клітинних ліній (звичайно біля –1⁰/хв) може бути досягнута при використанні обладнання різної складності, починаючи від спеціально пристосованого ящику з пінопласту, і закінчуючи повністю програмованим морозильним блоком.

Холодильники з рідким азотом. Вибір того чи іншого холодильника відбувається на основі економічних розрахунків з урахуванням використання рідкого азоту, початкових витрат, бажаної ємності сховища і зручності закладки матеріалу та його вилучення. При цьому морозильники з найбільш вузькими вхідними отворами, як правило, більш економічні.

Як вже зазначалося, ампули з клітинами можна зберігати у рідкому азоті або у його парах. Останній метод є більш зручним, так як, якщо у ампул залишаються капілярні проходи, вони не заповнюються рідким азотом, і тим самим ліквідується небезпека вибуху при розморожуванні. Дещо більш висока температура парів азоту не є, вірогідно, негативним фактором, за виключенням випадків довгочасного зберігання запасу клітин, призначених для розсіву.