Попередження інфікування культур

При роботі з культурами перш за все потрібно пересвідчитися, що бактерії не будуть внесені з тканинами. Цього можливо уникнути, вилучуючи тканини у асептичних умовах або використовуючи стерилізацію. Більшість внутрішніх тканин тварин є стерильними, за виключенням тих, що сполучаються з зовнішнім середовищем, наприклад дихальних шляхів і харчового тракту. Тому у більшості випадків необхідно лише вилучати їх у тварин таким чином, щоб уникнути інфекції. Ця техніка особливо є придатною у випадку роботи з ембріональним матеріалом.

У зрілих тканинах бактерії іноді можуть виявлятися, навіть якщо ці тканини вилучені з внутрішніх органів. Це відбувається не так часто і лише іноді виникає необхідність у спеціальних пересторогах. Однак, якщо препарати являють особливу цінність, або якщо є загроза їх зараження у процесі вилучення (як це часто відбувається з хірургічними препаратами до того, як вони потрапляють до лабораторії культури тканин), їх потрібно стерилізувати. Це можна легко зробити, використовуючи антибіотики; тканини промивають у дуже великих концентраціях препаратів, але вирощують у середовищі, що містить їх звичайні концентрації. Коли тканини, перед тим як їх розсікають для трансплантації, промивають розчином антибіотиків, виживають дуже мало мікробів.

Особливо складною проблемою є вивільнення від мікроорганізмів ростучих тканин холоднокровних організмів і хребетних. Однак використання антибіотиків значно спростило цю задачу, і у цьому випадку можна застосовувати методику, описану для хірургічних препаратів. Можна використовувати також і інші методи стерилізації, наприклад мертіолят 1 : 1000, ультрафіолетове світло і 10% розчин гексилрезорцину.

Якщо немає порушень техніки при підготовці тканин, середовищ і апаратури, то джерелом забруднення мікробами може бути лише повітря приміщення, де працюють з культурою тканин, або особи, цим зайняті. Цих джерел інфекції можна уникнути майже у всіх випадках, якщо дотримуватися небагатьох простих правил асептики. Досить рідко виникає необхідність у спеціально пристосованому приміщенні, що визначається характером проблеми, поставленої до вирішення. Наприклад, багато досліджень потрібно вести з молодими культурами, що ростуть лише на протязі декількох днів. У таких випадках немає необхідності у спеціальних заходах і, дотримуючись обережності, можна вирощувати молоді культури тканин у звичайній лабораторії. Якщо при цьому відбувається забруднення культур пилом та спорами з повітря, воно може бути знищене без великої шкоди для роботи і без втрати часу.

Поряд з цим відносно довгочасні експерименти, які продовжуються, наприклад від 2 до 3 тижнів, викликають необхідність у асептичному приміщенні. Воно не повинне бути спеціально обладнаним, але у ньому слід працювати тільки з культурами клітин. Це приміщення потрібно дотримуватися особливо чисто і у нього можна допускати на час культивування лише спеціальний персонал. При дотриманні суворої асептики немає необхідності у інших пересторогах.

Якщо ж у асептичній кімнаті регулярно працює багато осіб, бажано дотримуватися наступних правил:

1. Приміщення повинно бути постійно прибраним і чистим;

2. Матеріал, забруднений мікробами, у ньому не можна відкривати;

3. Коли проводиться асептична робота, до приміщення не можна входити або відчиняти двері без дозволу;

4. Всі робочі місця повинні бути перед роботою протерті спиртом;

5. Якщо забраковане середовище виливається у раковину, її потрібно ретельно промити водою на протязі декількох хвилин;

6. Після роботи стіл повинен бути прибраний і вимитий. Всі сліди крапель середовища і т.п. повинні бути відмиті;

7. Піпетки і пробірки повинні бути прибрані зі штативів негайно після використання. Невикористані матеріали слід дати на повторну стерилізацію;

8. Використані піпетки потрібно помістити у банку з водою. Інший скляний посуд, у якому знаходилося середовище або інші білкові розчини, повинен бути поміщений до відра з водою;

9. Чистий використаний скляний посуд повинен бути зібраний до дротяної сітки і відправлений на мийку;

10. Лише ті предмети, які дійсно відносяться до асептичної кімнати, можуть у ній залишатися.

Довгочасні експерименти з дуже цінними матеріалами можуть потребувати більш суворих пересторог. Так, може виникнути необхідність стерилізації повітря у асептичному приміщенні. Звичайно це здійснюється пропусканням повітря крізь ряд фільтрів або крізь камеру з ультрафіолетовою іррадіацією, де всі мікроорганізми гинуть; при цьому іноді подальшу очистку проводять з електростатичним уловлювачем пилу. За відсутності системи циркуляції повітря може бути частково стерилізоване при довгочасному ультрафіолетовому опроміненні; джерело світла при цьому повинне бути розташоване так, щоб світло не падало на працюючого, який може постраждати від опіків. Лампи звичайно монтують вище рівня голови у такому положенні, щоб всі промені були спрямовані догори. Таким чином, стерилізується все повітря над джерелом світла і пил, що несе бактерій, не падає на робоче місце.

Подальші заходи перестороги, яких повинно дотримуватися при роботі в асептичному приміщенні, пов’язані з позбавленням від пилу. Підлогу слід ретельно протирати крізь певні проміжки часу; підлогу, а також стіни слід обробляти вазеліновим мастилом, яке сприяє осіданню пилу.

Якщо виключити всі раніш згадані можливості, то єдиним джерелом інфікування може бути сам працюючий. Це залежить від наступних умов:

1. Пряме зараження від нестерильних предметів у процесі роботи;

2. Мікроби, що потрапляють з повітрям, яке видихається;

3. Мікроби, що переносяться з пилом, яка підіймається при рухах працюючого.

Пряме зараження може виникнути:

1. Від контактів апаратури, і зокрема піпеток, з нестерильними предметами та руками;

2. Від потрапляння мікробів, що знаходяться на краях контейнерів.

Досить часто звертають увагу на можливість зараження за рахунок дихання працюючого, вважаючи це однією з головних причин зараження культур. У дійсності це не так. При звичайному диханні викидається дуже небагато бактерій. Їх число однак значно підвищується під час розмови і кашлю. Тому інфікуванню бактеріями, що виділяються при видиху, можна запобігти двома шляхами – використанням маски і припиненням розмов при роботі.

Одним з найбільш небезпечних джерел пилу і, відповідно, мікробного зараження, є волосся працюючого. Якщо необхідно нахиляти голову над робочим столом або поблизу нього, потрібно вдягати шапочку. Крім того, необхідно триматися, наскільки це можливо, подалі від робочого поля.

Бактерійне і грибне забруднення додають додаткових перешкод для культивування клітин, однак у більшості випадків вони легко проявляються і тому приводять до менш серйозних наслідків ніж більш непомітне зараження мікоплазмами. Багато спеціалістів у галузі біології мікоплазм на протязі ряду років неодноразово показували, що присутність цих мікроорганізмів у культивованих клітинах практично зводить нанівець багато результатів досліджень, проведених з цими лініями клітин. Тим не менш складність виявлення цих мікроорганізмів і і переважання заражених культур серед об’єктів досліджень показує, що важливість цієї проблеми неможливо переоцінити.

Виявлення бактерій та грибів в культурах. Рекомендується такий порядок дослідження клітинних культур та підозрюваного культурального середовища на забруднення бактеріями і грибами:

1. Провести індивідуальне дослідження культуральних посудин за допомогою інвертованого мікроскопа, за можливості, з фазово-контрастною оптикою. Перевірка повинна бути особливо ретельною, коли передбачається культивування великої кількості клітин. Спочатку кожна культура проглядається при малому збільшенні.

2. В асептичних умовах відбирають порції культур, що перевіряються, і залишають проби культур в умовах ізоляції для подальшого аналізу. У випадку знайдення мікробної інфекції культури знищують.

3. Відібрані проби проглядають на вологому предметному склі під мікроскопом при великому збільшенні.

4. Готують мазки, фіксують їх нагріванням і фарбують будь-яким стандартним методом (наприклад, барвником Райта), після чого препарати аналізують під мікроскопом з масляною імерсією.

5. Співставляють отримані результати з фотографіями найбільш розповсюджених мікробних забруднень, розміщеними у відповідних посібниках.

Мікроскопічне обстеження придатне лише для виявлення сильних забруднень, але навіть і вони не завжди виявляються при простому мікроскопічному аналізі. Тому, щоб переконатися що клітини, які зберігаються і поживне середовище не містить грибів і бактерій, слід провести серію культуральних випробувань з використанням спеціальних випробувальних середовищ (Таблиця).

Таблиця. Пропоновані режими для виявлення бактерійних та грибкових забруднень у культурах клітин

Випробувальне середовище	Температура, С0	Постачання киснем	Час спостереження, доби
Кров’яний агар зі свіжою дефібрильованою кролячою кров’ю (5%) Тіогліколатний бульйон Триптиказний соєвий бульйон Бульйон з екстрактами серця та мозку Бульйон Саборада Бульйон YM Поживний бульйон з 2% дріжджовим екстрактом	37 37 37 37 37 37 37 37	аеробне анаеробне аеробне аеробне аеробне аеробне аеробне аеробне	14 14 14 14 14 21 21 21

Так випробування заморожених клітин слід проводити таким чином:

1. Зібрати і змішати вміст приблизно 5% всіх ампул даної партії, використовуючи шприц з голкою. Як правило, рекомендується не додавати антибіотики у середовище, призначене для культивування і збереження клітин запасу.

2. Відібраний матеріал висівають на одне зі згаданих випробувальних середовищ і інкубують відповідно методиці. У перевірку включають всі позитивні та негативні контролі. На наявність забруднень вказує утворення колоній на твердому середовищі або помутніння рідкого середовища у відповідних умовах вирощування.

Зараження культури клітин мікоплазмою, як вказано вище, створює значно більш складні проблеми, ніж зараження бактеріями і грибами. Присутність деяких видів мікоплазм у культурі може бути виявлена за дегенеративним ефектом, який вони викликають. Однак інші види мікоплазм можуть активно метаболізувати і проліферувати в культурі, не викликаючи будь-яких помітних морфологічних змін у лінії клітин, яку вони забруднюють.

На даний час існує 9 головних методів виявлення мікоплазми, з яких у більшості використовуються прямі культуральні випробування та непрямі дослідження з застосуванням біс-фензімідазольного флюорохрома Хехст 33258 для фарбування ДНК.