Кінетика росту клітин
Клітини тварин в культурі мають в багатьох відношеннях той же характер росту, що і мікроорганізми. Зокрема вони дають класичну картину кінетики росту, притаманну культурам бактерій, дріжджів та простіших. На початку культивування клітин настає лаг-фаза тривалістю від декількох годин до декількох днів перед початком росту. Потім ріст відбувається з постійним подвоєнням числа клітин популяції кожні 15-20 годин (у швидкоростучій культурі). Ця стадія відома, як логаріфмічна фаза росту. У кінці цієї фази досягається максимальне число клітин популяції, і клітини переходять у стаціонарну фазу. На протязі логаріфмічної фази популяція клітин нарощується у відповідності до формули:
де N0 - вихідна кількість клітин; N – кількість клітин на t годин; K – константа регресії. Середній час генерації (T), час, необхідний для подвоєння популяції клітин – величина, зворотна К (тобто T = 1/K).
Припинення росту клітин викликається вичерпанням харчових речовин або накопиченням токсичних продуктів обміну (особливо водневих іонів). Лаг-фаза, що спостерігається при пересіві культури на свіже середовище, може залежати від багатьох причин. Найбільш вірогідною з них є накопичення проміжних метаболітів у міжклітинному просторі.
Описаний тип кривої росту є особливо характерним для культур в суспензіях або при використанні малої кількості клітин для посіву. За інших умов такий класичний цикл росту може бути відсутнім.
Термін “ріст клітин” звичайно відносять до збільшення їх кількості, хоча збільшення клітинної маси може відбуватися без реплікації клітин. Різниця у середній масі клітин може бути досить значною при порівнянні різних клітинних популяцій, однак і у рамках однієї популяції величина середньої маси клітин може варіювати.
Швидкість росту культивованих клітин не завжди є тотожною. Вона може змінюватися в певних межах від одного штаму до іншого, але головним чином у залежності від зовнішніх умов, таких як рН, температура та осмотичний тиск.
Оптимальне значення рН для багатьох штамів клітин може бути дуже точно визначене. Звичайно воно лежить між 7,2-7,4 для клітин ссавців, і ступінь росту знижується при відхиленні значень рН від оптимального рівня. Це обумовлено зниженням швидкості подвоєння числа клітин, яке не залежить ні від подовження періоду лаг-фази, ні від кількості клітин, що досягається на протязі фази стаціонарного росту. Осмотичний тиск також впливає на швидкість росту, і для більшості клітин оптимум осмотичного тиску приблизно відповідає тому, який має місце в організмі тварини. Відхилення в обидві сторони від цього значення зменшує швидкість росту. У відношенні температури існує загальне правило: швидкість росту клітин підвищується зі збільшенням температури до максимуму, а потім вона починає стрімко знижуватися, що пов’язано з загибеллю клітин. Оптимальна температура розрізняється у залежності від виду тканини, але загалом дорівнює 37,50 для тканин ссавців та птахів.
Характеристичним параметром поведінки клітин у культурі є так зване контактне гальмування, або ж регуляція клітинного росту, що залежить від кількості клітин на одиниці площі. Максимальна щільність, яка може бути доступною для нормальних клітин у культурі, досягає 104/см2 клітин; кількість ракових клітин на два порядки вище (106/см2). Крім того, нормальні клітини, що ростуть на субстраті, являють собою моношарове утворення; у той ж час ріст клітин пухлин характеризується безладдям, в результаті чого виникають багатошарові утворення.
Для більшості культур клітин людей та тварин характерною особливістю є наявність критичної мінімальної концентрації клітин в інокуляті, тобто такої концентрації клітин в одному мілілітрі поживного середовища, при меншій за яку клітини будуть не в змозі індукувати власну проліферацію. Так загибель клітин, інокульованих за низьких посівних концентраціях, пояснюється через брак аутокринних ростових факторів, секретованих такою малою кількістю клітин. При цьому мінімальна критична концентрація в інокуляті є індивідуальною ознакою для кожної культури клітин. Проліферацію малої кількості клітин можна індукувати додаванням до середовища більшого об’єму сироватки, або використанням середовища кондиціювання – середовища, зібраного у експоненційній фазі росту від тієї ж культури клітин їз нормальною посівною концентрацією.
Іони амонію та лактат – продукти метаболізму глюкози і глютаміну, пригнічують ріст клітинних культур. Основна негативна дія лактату – це зниження рівня рН внаслідок його екскреції в культуральне середовище. Механізми інгібування проліферації клітин іонами амонію включають зміни електрохімічних градієнтів та зміни зовнішньоклітинного рівня рН.
За звичайних умов культивування клітини отримують енергію головним чином за рахунок гліколізу вуглеводів. В якості енергетичного джерела клітини тварин найчастіше споживають глюкозу. Іншим основним джерелом енергії в більшості середовищ є глютамін. Енергетичні потреби клітин до певної міри можуть бути забезпечені і за рахунок амінокислот, проте культивування без вуглеводів неможливе. Концентрація в середовищі глюкози, як і амінокислот, впливає на швидкість росту клітин. При культивуванні клітин різного походження виявлена деяка специфічність дії простих цукрів, що проявляється у зміні швидкості росту і морфології клітин.
Труднощі в застосуванні глюкози, особливо при підвищеній її концентрації, викликані тим, що гліколітичне перетворення її на лактат може призвести до швидкого значення рН середовища до його інгібуючого рівня. Однак швидкість перетворення вуглеводів на лактат знижується, якщо у якості додаткового джерела енергії клітини використовують глютамін. Таким чином низьку концентрацію глюкози до певної міри можна компенсувати збільшенням концентрації глютаміну, і навпаки. Додатковим способом регулювання утворення лактату може слугувати низька початкова концентрація глюкози з періодичним додаванням її у середовище в процесі культивування.
Глюкоза в основному метаболізується через гліколітичний шлях до пірувату, а останній перетворюється головним чином на лактат, який виділяється і накопичується в середовищі культивування. Поряд з цим піруват може перетворюватися на ацетил-СоА, який включається до циклу трикарбонових кислот. Невелика частина (4-8%) спожитої глюкози проходить через пентозо-фосфатний шлях, що постачає рибозо-5-фосфат для синтезу нуклеотидів.
Всі середовища для культивування культур клітин містять амінокислоти, оскільки вони є будівельними блоками для білкового синтезу, а також джерелом енергії. Для росту і розмноження більшості клітин людини та тварин потрібно щонайменше 13 амінокислот. Крім 8 амінокислот, необхідних організму людини, клітинам ссавців для розмноження в культурі потрібні ще 5 амінокислот: аргінін, цистеїн, глютамін, гістидин, тирозин. Необхідність присутності в середовищі цих п’яти додаткових амінокислот пов’язана перш за все з їх обмеженим синтезом клітинами як в організмі, так і в культурі. Більшість клітин в культурі найбільш інтенсивно споживають із середовища такі амінокислоти, як глютамін, ізолейцин, лейцин, цистеїн та аргінін. Із усіх 13 амінокислот, необхідних для розмноження більшості культур клітин, що тривало культивуються, лише глютамін піддається активному перетворенню. Інші амінокислоти включаються переважно в структурний клітинний білок. Оскільки глютамін слугує також джерелом азоту для клітинних культур, то лімітація по глютаміну призводить до збільшення споживання інших амінокислот, як компенсація зниження рівня азоту в живильному середовищі.
Глютамін може бути катаболізований декількома шляхами. Першим етапом завжди є дезамінування глютаміну в глютамат. Переважна більшість глютаміну в клітинах дезамінується глютаміназою, в результаті чого утворюється глютамат і вивільняється іон амонію. Шлях трансамінування є превалюючим шляхом метаболізму глютаміну в швидкозростаючих клітинних культурах. Невелика кількість глютаміну метаболізується через глютамат на -кетоглютарат. Це перетворення відбувається за допомогою глютамат-дегідрогенази; в результаті реакції утворюється аланін або аспартат. Аланін на практиці легко виходить із клітин і накопичується в культуральному середовищі.