- •7.092901 «Промислова біотехнологія» та
- •Культури клітин людини та тварин
- •Клітина
- •Клітинна активність
- •Поділ клітини
- •Типи клітин та тканин
- •Техніка, що використовується для первинного культивування клітин та тканин
- •Клітина та зовнішнє середовище
- •Температура
- •Осмотичний тиск
- •Концентрація водневих іонів
- •Інші неорганічні речовини
- •Необхідні метаболіти
- •Додаткові метаболіти
- •Природні середовища для культур клітин та тканин
- •Тканинні екстракти
- •Сироватка
- •Запобігання інфікування культур
- •Попередження інфікування культур
- •Фізіологічний стан культивованих клітин
- •Адгезія клітин до субстрату і біоматрикс
- •Диференцировка клітин
- •Вибір матеріалу
- •Кінетика росту клітин
- •Старіння клітинних культур
- •Крупномасштабне культивування
- •Адаптація до суспензійної культури
- •Широкомасштабне культивування суспензійних культур
- •Перехід від скляних посудин до посудин з нержавіючої сталі;
- •Більш складна система контролю середовища у зв’язку зі збільшеними потребами до переносу маси.
- •Клітини нерухомі, середовище перемішується (наприклад, реактор зі скляним намистом);
- •Гетерогенне перемішування (наприклад, реактор зі стопою пластин);
- •Гомогенне перемішування (наприклад, мікроносії).
- •Фактори, що визначають процес нарощування клітин
- •Типи культуральних систем
- •Проточні культури
- •Вибір між непроточною і проточною культурами
- •Дифузія крізь мембрани
- •Перфузія середовища
- •Потрапляння з газової фази
- •Нарощування культур клітин
- •Редокс-потенціал
- •Збереження і оцінка якості клітин
- •Створення банку клітинних ліній
- •Заморожування клітин і оцінка виходу
- •Обладнання
- •Підготовка до заморожування
- •Розморожування і оцінка виходу клітин
- •Проліферація у масовій культурі
- •Визначення якості клітинних ліній
- •Культури тканин та клітин вищих рослин
- •Контрольні запитання
- •Методи одержання первинних культур. Техніка, що використовується для первинного культивування клітин та тканин.
- •Збереження і оцінка якості клітин. Банки культур клітин. Запас для розсіву і запас для розподілу.
- •Література Основна
- •Додаткова
Фізіологічний стан культивованих клітин
Як правило, здатністю синтезувати специфічний для даного органу або тканини продукт володіють диференційовані клітини, тобто клітини, що спеціалізувалися у процесі розвитку організму на виконання певних функцій, наприклад клітини ендокринних залоз. Спроби введення таких диференційованих клітин у культуру і отримання з них постійних клітинних ліній - продуцентів фізіологічно активних речовин, наштовхується на низку суттєвих труднощів.
Передусім, диференційовані клітини нормальних тканин при поміщенні їх у культуральне середовище дуже погано, або ж зовсім не розмножуються. При цьому такі клітини дають початок культурам з обмеженим часом життя, тоді як культури клітин, отримані з пухлин, здатні проліферувати необмежено довгий час. Відомо і декілька ліній необмежено проліферуючих клітин (клітини нирки собаки MDCK, фібробласти 3Т3), які не перещеплюються при введенні тваринам, тобто не є пухлинородними.
Загалом клітинна біотехнологія ґрунтується на вирощуванні клітин, тканин чи органів in vitro на штучних живильних середовищах. Перенесення клітин у культуру in vitro означає припинення їх існування як одного з структурних елементів цілісного організму, до складу якого вони входили раніше. При цьому клітина в умовах in vitro виходить з-під контролю корелятивних факторів, що спрямовують і регулюють діяльність різних органів, тканин і клітин, як єдиного цілого. Умови і характер живлення клітин також зазнають істотних змін. Ці впливи, які за своєю силою перевищують межі норми реакції геному клітин, є стресовими і призводять до кардинальної перебудови функцій і метаболізму клітин, значного підвищення геномної мінливості, зміни напряму та інтенсивності дії клітинного добору і, як наслідок, до істотних змін в структурі клітинних популяцій. В результаті популяції культивованих клітин відрізняються від вихідних тканин високим рівнем гетерогенності й значними перебудовами геному. Масштабність і глибина таких перебудов можуть значно перевищувати навіть міжвидові відмінності, що існують у природі.
Нормальні клітини ростуть звичайно як недиференційовані стовбурні клітини або клітини-попередники, і настання диференцировки у такій культурі супроводжується іноді повним припиненням проліферації клітин. Деякі нормальні клітини, наприклад фіброцити і клітини ендотелія, здатні диференціюватися, потім дедиференціюватися, поновлювати проліферацію і знов диференціюватися. Інші, наприклад більшість кровотворних клітин, після початку диференцировки є нездатними до відновлення проліферації. Якщо ж адаптація нормальних клітин до культивування і відбувається, то вони, як правило, втрачають свої тканиноспецифічні функції, у тому числі здатність до синтезу специфічного продукту. Ті ж клітини, які придбали здатність до необмеженого росту у культурі, але зберегли функціональні особливості, часто мають властивість злоякісності, що теж накладує суворі обмеження на їх практичне застосування. І, нарешті, у процесі довгочасного культивування клітини піддаються каріотиповим і фенотиповим змінам.
Використання певних маркерів, специфічних для даного типу клітин, дозволяє визначити предків від яких отримані такі культури, але далеко не у всіх випадках вдається встановити положення клітин у їх “родоводі”. Для того, щоб клітини проліферували, вони повинні походити скоріш від недиференційованих клітин-попередників, ніж від повністю диференційованих клітин, у яких здатність до проліферації в нормі втрачається. Однак популяція не обов’язково повинна бути гомогенною і мати фіксований фенотип. Деякі культури, наприклад кератиноцити епідермісу, містять стовбурні клітини, клітини-попередники та інші. У такій культурі відбувається постійне оновлення за рахунок стовбурних клітин, проліферація та визрівання клітин-попередників та незворотна диференцировка.
Диференціювання та проліферація клітин регулюється не тільки щільністю моношару клітин, але, як вказувалося раніше, і живильними факторами середовища (сироватка, іони кальцію), а також гормонами та взаємодією з позаклітинним матриксом. Важливо, таким чином, не тільки встановити родовід клітин, що використовуються, але і охарактеризувати та стабілізувати стадію їх диференціювання, підбираючи щільність клітин, а також харчові та гормональні фактори для отримання однорідної клітинної популяції.