Сироватка

Серед біологічних середовищ, що виявилися придатними для культивування клітин поза організмом, найбільше розповсюдження отримали сироватки. Їх зазвичай використовують у якості компонента середовища культивування для культур клітин тварин. При цьому аутологічні чи гомологічні сироватки не володіють, очевидно, будь-якими перевагами, крім випадків, коли культивують деякі клітини дорослих. Певний відсоток сироваток завжди є токсичним для тканин, і аутологічні сироватки можуть бути такими ж токсичними, як і гетерологічні. Як правило, сироватка буває токсичною або нетоксичною незалежно від її походження. Найбільш часто отримують сироватку з крові або плаценти людини, а також з крові коней та телят.

Сироватки містить у своєму складі чимало різноманітних факторів росту. Сироватку додають до поживних середовищ в об’ємі від 2 до 20%. І хоча, як видно з викладення попереднього матеріалу, частково з’ясовані потреби клітин, для задоволення яких виробляють складні хімічно визначені середовища, додавання 2-20% сироватки було і, як правило, все ще залишається необхідним для підтримання оптимального росту клітин. Часто з різних причин буває необхідним позбавитися від неідентифікованих компонентів сироватки, тобто отримати хімічно повністю визначене середовище.

Сироватка являє собою надзвичайно складну суміш багатьох дрібних та крупних молекул, здатних як викликати, так і гальмувати ріст клітин. Найбільш важливими компонентами сироватки вважаються крупні молекули, а саме білки і зв’язані з ними продукти.

До головних функцій сироватки відносяться:

1. Забезпечення гормональними факторами, стимулюючими ріст клітин та їх функції;

2. Забезпечення факторами прикріплення і розпластування клітин (тобто, створення біоматриксу);

3. Забезпечення транспортними білками, які переносять гормони, мінеральні речовини, ліпіди, тощо.

У багатьох випадках клітини in vitro секретують мікроексудати, що містять аутокринні фактори росту і здатні заміщувати дію сироватки у середовищі. Склад мікроексудату залежить не тільки від типу культури клітин, що його секретує, але і від типу поверхні, на якій зростає культура.

Фактори росту. Більшість ростових факторів присутні у сироватці в концентрації декілька нанограмів на мілілітр і нижче. Деякі з цих факторів є специфічними для клітин на певній стадії диференцировки, як, наприклад, гематопоетичний фактор росту (колонієстимулюючий фактор). Деякі фактори діють синергічно, а дія ряду факторів не обмежується якимось певним типом клітин. Так фактор росту епітелію сприяє проліферації фібробластів, епідермальних клітин та клітин глії. Один і той же тип клітин може бути стимульованим різними ростовими факторами. Так, фібробласти розмножуються у відповідь на фактор росту фібробластів, фактор росту епідерміса, фактор росту, синтезований тромбоцитами та соматомедини. На даний момент роль фізіологічна роль всіх цих чисельних факторів не з’ясована.

Гормони. Зараз відомо дуже небагато щодо дії гормонів на клітини in vitro. Культури тканин вважаються ідеальною моделлю для вивчення дії гормонів, але, на жаль, сучасні відомості щодо цього явища недостатні. Безперечним є те, що присутність гормонів не є обов’язковим для виживання клітин, але з точки зору їх великого значення в організмі тварин вірогідна їх необхідність для повного розвитку функцій диференційованих клітин.

Серед гормонів найбільш важливим для інтенсифікації росту майже всіх типів клітин в культурі виявляється інсулін. Цей гормон звичайно додають в культуру у відносно високій концентрації, оскільки він швидко розпадається, а також інактивується цистеїном. Глюкокортикоїди (гідрокортизон, дексаметазон) можуть стимулювати або пригнічувати ріст клітин в культурі у залежності від типу клітин та їх щільності. Глюкокортикоїди впливають на проліферацію клітин, змінюючи їх чутливість до факторів росту. Деякі лінії клітин потребують інших стероїдних гормонів (естрадіолу, тестостерону, прогестерону). Гормони щитовидної залози (головним чином трийодтиронін) виявляються активними у підтриманні росту деяких клітинних ліній.

Транспортні білки. Роль цих білків полягає у переносі незамінних низькомолекулярних факторів. Альбумін серед інших факторів переносить вітаміни, ліпіди (жирні кислоти, холестерин) та гормони. Насичений залізом трансферрин є незамінним для більшості культивованих клітин, які несуть на своїй поверхні специфічні рецептори для цього білка.

Ліпіди. Сироватка є багатим джерелом різних ліпідів, необхідних культивованим клітинам для виживання і росту. Лінії клітин розрізняються за потребою у незамінних жирних кислотах, фосфоліпідах, лецитині та холестерині. Так наприклад, оптимальний баланс жирних кислот і холестерину варіює у значних межах для різних ліній кровотворних клітин і для однієї і тієї ж лінії на різних стадія визрівання. Деякі простагландіни (регуляторні молекули, що відносяться до ліпідів), які містяться у сироватці, включені до регуляції клітинної проліферації і діють разом з ростовими факторами, зокрема фактором росту епідермісу.

Мінеральні речовини. Клітини тварин in vitro зберігають ті ж потреби у поживних речовинах і ростових факторах, що і в організмі. Так, головними іонами поживних середовищ для них є Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Cl^-, HPO₄^2- i HCO₃^-, неорганічні солі в основному забезпечують підтримку електролітичного балансу та осмотичної рівноваги середовища. Роль присутніх у сироватці неорганічних мікроелементів (Cu, Zn, Co, Mn, Mo, Va, Se) з’ясована далеко не повністю, але багато з них можуть бути кофакторами ферментів. Так, наприклад, іони SeO₃^2- необхідні для активації ряду ферментів метаболічної детоксикації. Іони селену можуть також брати участь у інактивації вільних радикалів.

Не дивлячись на викладене вище, культивування клітин у присутності сироватки має ряд недоліків:

1. Для більшості клітин сироватка не є фізіологічною рідиною, з якою вона контактувала у вихідній тканині. Такий контакт міг здійснюватися, однак, в процесі загоєння ран і утворення кров’яних згустків; при цьому сироватка викликає ріст фібробластів, але гальмує ріст епідермальних клітин;

2. Сироватка має певну цитотоксичність. Окрім селективних інгібіторів, бактеріальних токсинів та ліпідів сироватка може містити поліаміноксидазу. Фермент діє на поліаміни (спермін, спермідин), що є продуктами секреції швидко проліферуючих клітин, в результаті чого утворюються цитотоксичні поліаміноальдегіди. Відмічено, що ембріональна сироватка великої рогатої худоби і сироватка вагітних жінок, на відміну від сироватки коней, містять відносно велику кількість цього ферменту;

3. Значні зміни властивостей сироватки від партії до партії роблять необхідним ретельний скринінг сироваток, що займає багато часу і дорого коштує;

4. Сироватка може містити недостатню кількість специфічних для даних клітин ростових факторів, що веде до необхідності додавання цих факторів до культур клітин.

При культивуванні деяких клітин у якості додаткового джерела харчування широко використовуються ультрафільтрати сироватки, позбавлені крупних білкових молекул. Для отримання таких ультрафільтратів необхідне спеціальне обладнання, однак їх застосування є виправданим для попередження накопичення жиру в процесі культивування тканин.

Кожний, хто використовує культуру клітин у звичайних лабораторних масштабах і потребує суворого контролю умов культивування, може використовувати безсироваткове середовище, щоб запобігти варіабельності у кількості різних неідентифікованих компонентів у сироватці. Існують дві головні причини використання безсироваткових середовищ при роботі з великою кількістю клітин, наприклад з гібридомами, які продукують моноклональні антитіла, з фібробластами, що синтезують інтерферон, а також з лімфомами, що секретують лімфокіни та інші фактори. Ці причини: а) необхідність уникнути присутності чужорідного білка, від якого, у іншому разі, прийдеться очищати отриманий продукт і б) висока вартість ембріональної сироватки великої рогатої худоби.

Для підтримання функціонально активного стану клітин у культурі була суттєвою розробка відтворюваних умов культивування. Для цього були розроблені стандартні прописи ефективних поживних середовищ, найбільш відомим з яких є середовище Ігла. При цьому, якщо до складу поживного середовища потреби з боку клітин не дуже суворі, то можливі коливання реакції середовища є досить обмеженими. Так оптимум рН знаходиться у межах 7,2 – 7,4, а зменшення або збільшення рН на 0,2 – 0,4 супроводжується загибеллю клітин у культурі. При подовженому культивуванні підвищується потреба у буферному розчині. Як правило, перевага віддається гліцил-гліциновому, трис- та ХЕПЕС-буферам. Щодо сироватки, як необхідного компоненту середовища, то її вплив на функціональний стан клітин у культурі тим вище, чім молодше тварина, від якої ця сироватка отримана.

Зараз можна виділити ряд різних середовищ, які пропонуються різними фірмами для оптимізації культур клітин ссавців:

1. Середовища з сироватковими добавками. Клітини вирощуються у головному середовищі, що містить невелику кількість сироватки, і збагаченому сироватковими добавками. Такі сироваткові добавки містять зазвичай інсулін, трансферрин, селеніт та ростові фактори (частіш за все фактор росту фібробластів, фактор росту епідермісу та фактор росту, синтезований тромбоцитами). Назви добавок – GF, ITS, GF3, GF9 i SerXtend.

2. Середовища з замінниками сироватки. Клітини вирощуються у головному поживному середовищі (наприклад, у суміші середовищ RPMI 1640 та DME), до якої додають певні замінники сироватки. До складу замінників звичайно входять інсулін, трансферрин, ростові фактори (частіш за все фактор росту фібробластів, фактор росту епідермісу та фактор росту, синтезований тромбоцитами) і гормони (як правило, гідрокортизон або дексаметазон, трийодтиронін, прогестерон). Назви замінників – Nutricyte, HCGS (Hybridoma Cell Growth Supplement), CLEX, Serum Plus, Nu-Serum.

3. Безсироваткові середовища. Клітини ростуть без добавок у цих середовищах (наприклад, суміш DME/F12 у співвідношенні 1 : 1 по об’єму) до складу яких звичайно входять інсулін, трансферрин, селеніт, частково альбумін (фракція V), фетуїн, тестостерон, етаноламін, деякі жирні кислоти, піруват та мікроелементи. Найменування – НВ 101, НВ 102, HL-1, DME, IMDM, KC-2000, BM-86 (Wissler).