Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
О.В. КАРПОВ-БІОТЕХНОЛОГІЯ КУЛЬТУР РОСЛИН І ТВАР...doc
Скачиваний:
7
Добавлен:
19.08.2019
Размер:
534.02 Кб
Скачать

Концентрація водневих іонів

Для кращої життєздатності клітин рН біологічних рідин повинен бути близьким до нейтрального. Однак більшість клітин витримує значні коливання рН. Так, наприклад, звичайна клітина ссавців виживає невизначений строк при рН у межах 6,6-7,8. Відмічені випадки росту клітин та їх диференціації при значеннях рН, значно більш високих, ніж 8,0; деякі клітини вдавалося також підтримувати довгий час при рН нижче 6,6. Слід вважати загальним правилом те, що оптимальний ріст клітин відбувається при значеннях рН між 7,2 та 7,4 і що небажаним є відхилення рН від меж 6,8-7,6. При рН, перевищуючих 7,8, багато типів клітин гинуть на протязі 48 годин, і це спостерігалося також, якщо клітини утримувалися при рН, більш кислому, ніж 6,8.

Інші неорганічні речовини

Для всіх клітин необхідна присутність інших неорганічних речовин на додаток до тих, що контролюють осмотичний тиск та концентрацію водневих іонів. Для більшості клітин тварин необхідні іони натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, а також карбонати, фосфати і, можливо, сульфати. Функція деяких з них неясна. Іон натрію головним чином необхідний для підтримки осмотичного тиску середовища. Іон калію може слугувати для цих же цілей в клітині, але можливо, що він володіє і іншими специфічними властивостями. Іони кальцію та магнію необхідні для функції деяких внутрішньоклітинних ферментів; в той же час іон кальцію може бути особливо пов’язаний зі змінами між станами цитоплазми у вигляді золю і гелю. Обидва іони, як кальцію, так і магнію, очевидно, є необхідними для росту клітин на поверхні скла. Залізо необхідне для деяких дихальних пігментів, і особливо цитохромів. Іон бікарбонату необхідний для багатьох важливих біохімічних процесів у клітині, і крім того, виконує одну з головних функцій буфера у середовищі. Іон фосфору необхідний для обміну енергії, оскільки більша частина енергії клітини підтримується у формі макроергічних фосфатних зв’язків; він також відіграє роль буфера. Значно рідше для розвитку клітини потрібний іон сірки. Але вважається, що і цей іон є необхідним, оскільки радіоактивний сульфат активно включається в клітинні білки. Для тих клітин, які синтезують сірковмісний мукополісахарид, присутність сульфату у середовищі є обов’язковим.

Необхідні метаболіти

Вуглеводи. Наявність джерел вуглеводів є обов’язковими для культивованих клітин. Найбільш розповсюдженим джерелом вуглеводів є, звичайно, глюкоза, хоча вона може бути замінена іншими речовинами, головним сином фруктозою та маннозою. Можуть бути використані також мальтоза та багато дисахаридів та полісахаридів, але для цього майже завжди необхідним є їх розщеплення до моносахаридів. Глюкоза може також бути заміненою на більш прості молекули. Так, було показано, що лактат і піруват можуть задовольняти енергетичні потреби клітини при надлишку кисню. У деяких випадках клітини здатні виживати у відсутності глюкози на протязі значного часу. Особливо це відноситься до кислот, які володіють протеолітичною активністю, оскільки деякі з них здатні до дезамінування і можуть використовувати потім амінокислотні залишки у якості джерела енергії.

Гази. Кисень і вуглекислий газ, очевидно, є необхідними для виживання клітин. Вважається, що деякі типи клітин здатні виживати на протязі довгого строку при повній відсутності кисню і отримувати всю енергію за рахунок анаеробного гліколізу. Однак маловірогідно, що будь-яка клітина організму тварини може виживати довгий час за відсутності кисню, оскільки для синтезу різних компонентів клітини необхідні супутні продукти циклу і, якщо їх не буде у середовищі, клітини загинуть від виснаження.

Необхідність двоокису вуглецю в середовищі є дещо спірною. Це пояснюється тим, що практично неможливо повністю виключити присутність двоокису вуглецю за рахунок клітин, оскільки він є продуктом обміну і одразу ж зв’язується катіонами середовища. Однак принаймні для деяких типів клітин іон двоокису вуглецю є абсолютно необхідним. Крім того, даний іон виконує функцію буфера у більшості поживних середовищ і для більшості систем підтримує певний тиск двоокису вуглецю в атмосфері і середовищі. Це досягається або додатковим введенням газу в посуд для культивування, або герметичністю посуду, коли двоокис вуглецю, що утворюється в процесі обміну, зберігається.

Склад газової суміші визначається трьома факторами: а) типом середовища; б) використанням відкритих (чашки Петрі, багатолункові чашки) або зачинених (флакони, бутлі) культуральних судин і в) необхідною буферною ємністю. Деякі параметри культивування можуть варіювати, але при цьому повинні витримуватися одне головне правило і основні умови. Правило полягає в тому, що концентрація бікарбонату і парціальний тиск СО2 повинні знаходитися у рівновазі. Три основні умови можна підсумувати наступним чином:

НСО3

Газова фаза

HEPES

1. Низька буферна ємність, герметично закриті флакони

4 мМ

Повітря

-

2. Помірна буферна ємність, відкриті або герметично закриті флакони

23 мМ

5% СО2

-

3. Висока буферна ємність, відкриті або герметично закриті флакони

8 мМ

2% СО2

20 мМ

Слід пам’ятати, що співвідношення СО2/НСО3 є суттєвим для більшості клітин, так що ні флакони, ні чашки не можуть бути використані без наявності СО2 в атмосфері.

Амінокислоти. На даний час встановлено, що більшість клітин має специфічну потребу у 12 амінокислотах. До них відносяться: аргінін, цистін, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан, тирозин та валін. Дуже рідко зустрічаються окремі клітини, потреби яких в амінокислотах дещо відрізняються. Так, для деяких культур органів потрібна менша кількість амінокислот (можливо, що у цьому випадку відбувається реутилізація продуктів розкладу з інших частин тканини).

На додаток до так званих основних амінокислот, обов’язкових для тварин, можна включити цистін та тирозин. У здорових тварин цистін та метіонін можуть заміщувати один одного і тому цистін не може вважатися незамінною амінокислотою. Але для росту і виживання культивованих клітин цистін є необхідним незалежно від присутності метіоніну. Аналогічно цьому, фенілаланін у здорової тварини досить швидко перетворюється на тирозин, але в більшості звичайно культивованих клітин таке перетворення не спостерігається, або не досягає рівня, необхідного для виживання клітин. Внаслідок цього тирозин розглядається як незамінна амінокислота для культур клітин.

На додаток до згаданих амінокислот більшість клітин потребує глютамін. Ця сполука зустрічається у непошкодженому вигляді в білках клітин. Однак причина порівняно високої потреби в глютаміні полягає в тому, що -аміногрупи інших амінокислот походять не від глютаміну. Є багато інших важливих функцій в обміні речовин для цієї речовини, зокрема глютамін може використовуватися для синтезу нуклеїнових кислот.

Вітаміни. Для росту клітин потрібні чисельні вітаміни. Більшість з них відносяться до групи В. Відомо, що більшість вітамінів даної групи складає суттєві частини коензимів, що беруть участь в обміні, і тому зрозуміла їх необхідність при культивуванні клітин. До вітамінів, які, як це встановлено, є необхідними, відносяться параамінобензойна кислота, біотин, холін, фолієва кислота, нікотинова кислота, пантотенова кислота, піридоксаль, рибофлавін, тіамін, інозит. Нікотинова кислота може бути заміненою на нікотинамід, а піридоксаль – на піридоксин. Цікаво, що для виживання клітин немає необхідності у інших вітамінах.