Старіння клітинних культур

Культури нормальних диплоїдних клітин більшості, якщо не всіх видів тварин, піддаються процесу, який прийнято називати “старінням” клітинних культур, або клітин у культурах. Це явище полягає у тому, що диплоїдні клітини in vitro проходять певний цикл, зо завершується припиненням мітозів, звичайно з наступною загибеллю клітин. Обмеження часу життя клітин в культурі, на відміну від бактерій, зберігається навіть при умові постійного переносу їх на свіже поживне середовище. Виключення з цього правила складають трансформовані та пухлинні клітини.

Термін "старіння” та “вік” відносно до клітин у культурі до деякої міри умовні і часто беруть у лапки. Дійсно, хоча є вагомі підстави вважати, що реплікативне “старіння” диплоїдних клітин, що спостерігається при культивуванні їх in vitro, відбивають ті ж процеси, що і природне старіння організмів, і навіть є цитологічною основою природного старіння, однак беззаперечних доказів єдності цих двох процесів поки не отримано.

Обмеженість часу життя клітин в культурі вперше була доведена на початку 60 років минулого сторіччя в роботах Хайфліка, де було встановлено, що здатність диплоїдних клітин до поділу обмежена, і що кількість подвоєнь популяції культивованих клітин і специфічною для виду.

Культури клітин проходять in vitro певні етапи розвитку. Звичайно виділяють три фази: після адаптації у первинній культурі (фаза І) клітини починають ділитися, заповнюючи моношаром дно культуральної посудини, і за сприятливих умов і своєчасних пересівах діляться безперервно певне число разів (фаза ІІ), після чого культура “старіє” – проліферація уповільнюється, потім поділ повністю припиняється, і через різні для різних культур строки клітини дегенерують і гинуть (фаза ІІІ). Слід підкреслити, що головним критерієм вступу клітин до фази ІІІ є припинення мітозів, а клітини, що не діляться, можуть залишатися живими досить довго. У зв’язку з цим прийнято говорити про “реплікативне старіння” клітинних культур.

Тривалість фази ІІ, на протязі якої клітини стабільно діляться, визначається не часом який клітини провели в культурі, а числом проведених подвоєнь популяції. Для фібробластів людини це число складає приблизно 50  10 подвоєнь. Близькі значення отримані і для інших культивованих клітин людини. При цьому, якщо проліферацію клітин у фазі ІІ штучно призупинити, наприклад шляхом заморожування, то перерва у поділах (іноді багаторічна) ніяк не відбивається на загальній кількості подвоєнь.

Важливо мати на увазі, що наведене число 50  10 відноситься не до максимального числа поділів клітини в культурі, а до числа подвоєнь популяції культивованих клітин.

Чим молодше вік джерела, з якого отримані клітини для культивування у культурі, тим більшу кількість разів вони здатні поділитися до того часу, як загинути. Щодо рослинних клітин, то дані, отримані щодо розмноження саджанців, свідчать про необмежену здатність клітин рослин до поділу.

Крупномасштабне культивування

На невеликих культурах клітин, що ростуть, наприклад, у флаконах до 1 л (площа поверхні 175 см²), зручно вивчати морфологію клітин або порівнювати ефекти різних агентів або різних концентрацій одного і того ж агента на ріст і метаболізм клітин. Існує, однак, багато задач, для виконання яких потрібна велика кількість клітин. Прикладами можуть слугувати отримання клітинних компонентів (з 10⁹ клітин можна отримати 7 мг ДНК), отримання вірусів для виробництва вакцин (у загальному випадку 5  10¹⁰ клітин на культуральний флакон) або інших клітинних продуктів (інтерферон, активатор плазміногену, різні гормони, ферменти та антитіла), а також отримання інокулятів для культур ще більшого розміру.

З метою промислового виробництва фізіологічно активних речовин вважалося перспективним використовувати культури клітин відповідних органів людини та тварин. На перший погляд вирішити цю проблему досить нескладно. Зараз існують добре відпрацьовані методи переводу клітин у культуру. Залишається лише виділити з тканин організму клітини, що синтезують ту або іншу цінну речовину, перенести їх у відповідне живильне середовище, наростити потрібну біомасу і виділити бажаний продукт.

Отримання великої кількості клітин збільшення числа невеликих стаціонарних культур виявляється справою трудомісткою та досить витратною. Природним шляхом вирішення цієї проблеми є збільшення розмірів культурального посуду. На жаль, масштаб культури не зростає пропорційно розмірам культуральної судини. Зі зростанням розміру судини змінюються параметри росту клітин, що потребує певної модифікації системи. Це стосується як клітин, що ростуть в суспензіях, так і клітин, які здатні рости лише після прикріплення до субстрату (залежні від субстрату клітини).

До основних способів організації біосинтезу клітин ссавців обох названих типів в умовах in vitro відносять:

а) циклічний (періодичний) – при цьому способі культивування поживне середовище знаходиться в культуральній системі, постійно виснажується внаслідок життєдіяльності клітин, паралельно у поживному середовищі відбувається накопичення продуктів життєдіяльності;

б) відкритий (безперервний) – при такому способі культивування відбувається постійне надходження в культуральну систему поживного середовища і водночас видаляється рівна кількість відпрацьованого середовища, яке містить продукти життєдіяльності клітин;

в) дробний (від’ємно-доливний) – у цьому випадку періодично, у міру зниження концентрації поживних речовин у культуральній суспензії і накопичення продуктів життєдіяльності клітин, замінюють відпрацьоване середовище свіжим, при підтриманні постійного робочого об’єму;

г) перфузійний – цей способ культивування забезпечує безперервний потік поживного середовища через зону його споживання.

Вибір того чи іншого способу культивування визначається фізіологічними потребами клітинної культури і методом керування процесом, а також способом накопичення (екзо- чи ендогенним) цільового продукту або біомаси клітин. З огляду забезпечення клітин поживними речовинами і видаленням продуктів життєдіяльності, оптимальним є відкрите і перфузійне культивування. Ці способи використовується при культивуванні як моношарових субстратзалежних, так і суспензійних клітинних ліній. При культивуванні непроліферируючих первинних суспензійних і субстратзалежних клітин використовують, як правило, циклічний і дрібний способи культивування

Етап біосинтезу цільового продукту загалом впливає як на ефективність біотехнологічного процесу, так і на наступні технологічні операції. При цьому життєздатність клітин-продуцентів є визначальним показником. Остання залежить від цілого ряду фізичних і хімічних характеристик, за яких відбувається біосинтез.

Як вже вказувалося, вирішальними факторами забезпечення життєдіяльності клітин ссавців звичайно вважають оптимальний температурний режим (у межах 36-37°С); рівень рН середовища (на рівні 7,2-7,5), а також забезпечення киснем (рО₂ = 10-50%) Але умови культивування еукаріотичних клітин не вичерпуються переліченими фізіологічними факторами і багато в чому визначаються типом застосованого біореактора, його геометрією, видом енергії, яка підводиться, складом поживного середовища тощо.

Однією з головних задач при розробці крупномасштабних біотехнологічних систем культивування клітин ссавців є забезпечення життєдіяльності клітинної популяції in vitro, тобто створення необхідних фізичних і хімічних умов оточуючого середовища, що відповідають фізіологічним потребам культури При цьому слід враховувати і ту обставину, що використання багатих поживних середовищ і температурного режиму є фактором активації контамінуючої мікрофлори. Це у свою чергу висуває високі вимоги до асептики культуральних систем і технологічних операцій.

Спершу розглянемо крупномасштабне культивування субстратзалежних клітин. Незважаючи на багато технологічних недоліків, які їм притаманні, такі клітини широко використовуються як в наукових дослідженнях, так і фармацевтичній промисловості. При цьому культури субстратзалежних клітин мають ряд переваг перед суспензійними:

1. Дуже легко проводити повну заміну середовища і промивати пласт клітин перед додаванням свіжого середовища. Це особливо важливо у тих випадках, коли ріст клітин відбувається в одних експериментальних умовах, а напрацювання продукту – в інших умовах, зокрема при переносі клітин з середовища з сироваткою до безсироваткового середовища. Ефективність заміни середовища в моношарових культурах є такою, що дозволяє досягти повного видалення небажаних компонентів;

2. Якщо потрібні штучно високі щільності клітин, то цього можна досягти за допомогою використання перфузійної техніки. Моношарові культури сильно полегшують застосування перфузійних систем, оскільки у цьому випадку відпадає необхідність використання тонких систем фільтрації для утримання клітин;

3. У багатьох клітин експресія бажаного продукту відбувається значно ефективніше, якщо клітини прикріплені до субстрату;

4. Одна і та ж апаратура може бути використана з різним відношенням середовище/клітини, яке, зрозуміло, може легко бути змінене у ході процесу культивування;

5. Моношарові культури забезпечують найбільшу гнучкість досліджень, оскільки вони можуть бути використані для будь-якого типу клітин. Якщо потрібно використати декілька типів клітин, то слід вибирати саме моношарову культуру.

У моношарових культур, в порівнянні з суспензійними, можна відмітити чотири головних недоліки:

1. Моношарові культури є порівняно працевитратним і дорогими при збільшенні масштабу;

2. Потребують значно більшого простору;

3. Неможливо з достатньою ефективністю відстежувати ріст клітин, оскільки важко відбирати проби і підраховувати клітини;

4. Більш важко визначати і контролювати такі параметри, як рН та О₂ і забезпечувати гомогенність клітин.

У всіх випадках використання мікроносіїв виправляє ці недоліки моношарових культур.

Нарощування клітинної біомаси поверхневозалежних культур можна здійснювати, культивуючи їх на поверхнях флаконів, роллерних посудин, або на поверхнях носіїв у біореакторах.

Першими технологіями, які були апробовані для нарощування клітинної біомаси поверхневозалежних культур, були найпростіші технології для стаціонарного культивування у флаконах та інших посудинах. Проте, при необхідності виробляти великі об’єми різноманітних препаратів, такі технології культивування клітин поверхневозалежних культур стають нерентабельними. Тому на сучасних підприємствах світу з циєю метою широко застосовуються біореактори різноманітних конструкцій, основним елементом яких є наявність розвиненої поверхні росту, що заповнює практично весь об’єм культивування.

Зараз для крупномасштабного культивування субстратзалежних клітин широко використовуються культиватори роллерного типу, принцип роботи яких полягає в обертанні розташованих горизонтально або під кутом 15-30° ємностей з культуральною суспензією. При роллерному культивуванні в якості культуральних ємностей використовуються роллерні флакони, сулії або їхні пластикові аналоги. З тією ж метою використовються пробірки, чашки Петри, імунологічні планшети та різноманітний скляний посуд, що розташовується в обертових апаратах. Для поточного контролю за густиною культивованих клітин роллерні установки іноді устатковують оптичним пристроєм для визначення цього параметру. Процес культивування клітин в таких роллерних установках останнім часом намагаються повністю автоматизувати.В лабораторії для культивування субстратзалежних клітин використовують флакони і пробірки, що забезпечують поверхню росту 5-200 см². Найбільшими стаціонарними флаконами, які звичайно використовуються в лабораторії, є флакони Ру або їх пластикові одноразові аналоги. Ці посудини мають поверхню для росту клітин 175-200 см² (у залежності від типу посудини), потребують для росту клітин 100-150 мл середовища; об’єм газової фази складає 750-1000 см³. У цих флаконах можна отримувати 2  10⁷ диплоїдних клітин і до 10⁸ гетероплоїдних клітин. За необхідності отримання, наприклад, 10¹³ клітин у цьому разі прийдеться використовувати більш 100 однакових культур, так що всі маніпуляції з клітинами доведеться повторювати не менш 100 разів. Тому для отримання великої кількості клітин, залежних від субстрату, слід використовувати більш досконалу техніку культивування; це дозволяє більш доцільно використовувати обслуговуючий персонал, а також суттєво підвищити відношення поверхні росту клітин до об’єму культури.

Як стає зрозумілим з викладеного вище матеріалу, для отримання оптимальної кількості субстратзалежних клітин в культурі необхідно забезпечити клітини максимальною поверхнею для росту, зберігаючи при цьому максимум об’єму середовища і повітряної фази. Стаціонарні культури володіють тільки однією поверхнею, до якої можуть прикріплюватися клітини, тому вони потребують більшого об’єму середовища. Кількість середовища може бути знижена при розміщенні культури на качалку або, частіш, при використанні обертових циліндричних посудин. В обертових бутилях майже вся внутрішня поверхня доступна для росту клітин, хоча у кожний момент часу лише 15-20% поверхні бутлю вкрите середовищем. При обертанні бутилю клітини почергово опиняються на повітрі або під середовищем, тоді як в стаціонарній культурі спостерігаються майже анаеробні умови. Цей метод культивування дозволяє знижувати об’єм середовища, але все ще потребує значної повітряної фази для отримання достатньої кількості кисню та потрібного рН. Збільшення масштабу культури при використанні обертових бутилів потребує використання посудин з мінімально можливим діаметром. Поверхня росту може бути збільшена удвічі як за рахунок подвоєння діаметру, так і за рахунок подвоєння довжини. Однак у першому випадку об’єм середовища в повітряній фазі збільшиться в 4 рази, а у другому випадку – тільки у 2 рази. Єдиним способом збільшення продуктивності звичайних обертових бутилів і зниження їх об’єму є використання перфузійної системи, що розглядається далі. Однак всередині таких обертових бутилів можна штучно збільшити поверхні для росту клітин. Для цього розроблені такі штучні пристрої:

• Плівки. Великі культуральні посудини розміром 25  10 см оснащується патроном, який містить згорнуту по спіралі пластикову плівку з загальною поверхнею 8500 см². Після прикріплення клітин посудина встановлюється вертикально, і, оскільки вона вся заповнена середовищем (1,8 л), аерація здійснюється шляхом пробулькування. Ця система успішно використовується для ліній гетероплоїдних клітин, таких як ВНК та 3Т3. Головним моментом для використання цієї системи є рівномірність розподілу клітин по поверхні спіралі; у противному випадку ріст клітин буде нерівномірним і вихід знизиться.

• Скляні трубки. В обертовий бутель поміщується пучок паралельних дрібних скляних трубок, розділених силіконовими прокладковими кільцями. В ході культивування клітин посудина піддається перфузії середовищем з зовнішнього резервуару. В такій системі вдається отримати 3,2  10⁹ клітин Vero на протязі 6 діб з використанням 6,5 л середовища.

• Пластини. Принципи, що лежать в основі таких систем, часто знаходять застосування як в крупних, так і в невеликих лабораторних установках. Так, використовуються патрони на 40 дисків, розміщених паралельно на центральному стрижні. Посудина наполовину заповнюється середовищем і використовується як звичайний обертовий бутель.

Культивування на плоских поверхнях може здійснюватись на багатолоткових пристроях стаціонарного типу, які складаються з набору пласких плат, що утворюють при збірці єдину систему. Такі установки устатковують пристроями завантаження-вивантаження поживного середовища і клітин, а також системою забезпечення повітрям. Більш прості установки цього типу являють собою герметичні ємності, всередині яких розташовані плоскі горизонтальні елементи для росту клітин. Для одержання більшої кількості клітинних продуктів у біореакторах невеликого об’єму використовують гетерогенні системи, призначені для культивування субстратзалежних моношарових клітин. У таких системах використовують обертові ростові поверхні з іммобілізованими клітинами. Останнє дозволяє досягти кращого забезпечення клітинної суспензії компонентами поживного середовища і розчиненого кисню за рахунок постійного омивання клітин середовищем, що перемішується.

Гетерогенні системи можуть являти собою біореактори, у яких ростовою поверхнею є стопа круглих пластин або спіральна поверхня. При цьому застосовуються круглі пластини зі скла або нержавіючої сталі, що встановлюються на вертикально або горизонтально розташованому центральному стрижні. Перемішування культурального середовища здійснюється шляхом обертанням патрона з пластинами або обертанням ємності з нерухомими пластинами в роллерній установці. Об’єм рідини при цьому може складати 0,5 об’єму культуральної ємності, що дозволяє забезпечити клітинну суспензію газовою сумішшю, яка знаходиться в ємності.

• Культури на порожнистих волокнах. Пучки синтетичних порожнистих волокон є таким же матриксом, як і судинна система, і дозволяють клітинам досягати щільності подібної до такої у тканині. Порожнисті волокна звичайно використовуються в ультрафільтрації завдяки здатності до селективного проникнення макромолекул крізь пористу стінку волокон при постійному протіканні рідини крізь просвіт волокон. Якщо пучок таких волокон помістити у патрон і закрити з обох сторін, то при пропусканні крізь патрон культурального середовища вони будуть проходити крізь стінки волокон, забезпечуючи більшу поверхню для прикріплення і росту клітин.

Культуральні камери, побудовані за цим принципом (“вітафібр”), поставляються фірмою Amicon Corporation. Капілярні волокна виготовляються з акрилового полімеру, мають діаметр 350 мкм та товщину стінки 75 мкм. Пори у стінках волокон обмежують проникнення макромолекул з молекулярною масою між 10000 та 100000 дальтон. Визначити загальну поверхню такого блока, доступну для росту клітин, важко. Однак фірма постачає блоки різного розміру, і вони характеризуються дуже високим відношенням робочої поверхні до об’єму культурального середовища (біля 30 см²/см³). У цій системі можна виростити до 10⁸ клітин/мл.

• Культуральна система на основі кераміки. Недавно запропонована нова культуральна система, у якій для росту клітин використовується керамічний матеріал. Він складається з циліндричного керамічного патрона (існують варіанти з робочою поверхнею від 4,25 до 18 м²) з каналами площею 1 мм² по всій довжині циліндру. Систему доповнює перфузійний контур у зовнішній резервуар, де здійснюється контроль якості середовища. Система забезпечує високе відношення робочої поверхні до об’єму (40 : 1), а результати випробувань показали придатність циєї системи для виробництва вірусів та поверхневих антигенів клітин.

• Пластикові мішки. Мішки, виготовлені з фтор-етилен-пропіленового сополімера (ФЕП-Тефлон), є біологічно інертними, але характеризуються дуже високою проникненістю для газів. Мішки розміром 5  10 см, заповнені клітинами і середовищем (товщина шару 2-10 мм), можуть бути поміщені у термостат. Система забезпечує достатнє постачання культури киснем (клітини ростуть всередині мішка і відокремлені від повітря мембраною товщиною 25 мкм), що дозволяє отримувати високу щільність клітин. Культуру можна поміщати на качалку або обертати для підтримання гомогенності середовища. Клітини можна знімати звичайною трипсинизацією або механічно, шляхом вивертання мішка і зскрібання клітин.

• Культивування з пластиковою плівкою. Цей метод використовує той же самий матеріал (ФЕП-Тефлон), але не у вигляді мішків, а у вигляді довгих трубок, закручених з прокладками на котушку. Середовище прокачується крізь трубки і може або вилучатися, або рециркулювати крізь зовнішній резервуар. Газообмін між середовищем та повітряним простором термостата здійснюється крізь стінки трубок. Довжина трубок, що використовуються, може досягати 10 м, а їх робоча поверхня, придатна для росту клітин, складає 25000 см².

При культивуванні субстратзалежних моношарових клітин використовують до того ж і більш досконалі з погляду забезпечення клітин компонентами поживного середовища і видалення продуктів метаболізму перфузійні системи. Перфузійний спосіб культивування передбачає безперервну рециркуляцію поживного середовища крізь зону її споживання.

Класичним прикладом перфузійного реактора є апарат з вертикальним валом, на якому закріплений фільтр, виконаний у вигляді конуса, який звужується донизу. Клітинна суспензія завантажується в об’єм конусу, обмежений фільтром. При перемішуванні фільтр заважає видаленню клітин з культурального об’єму, не перешкоджаючи при цьому постійному надходженню свіжого поживного середовища і одночасно виходу відпрацьованого середовища. Обертання фільтра виконує як функцію перемішування культури, так і постійного очищення фільтру від закупорювання його пор клітинами.

Для одночасного культивування декількох зразків клітин в ідентичних умовах розроблена камера культивування, у якій газозабезпечення і подача живильного середовища здійснюються перфузійним методом. При цьому у якості горизонтальної ростової поверхні використовується пористий матеріал. При перфузії поживного середовища у якості ростової поверхні виступають синтетичні порожнинні волокна, що слугують одночасно і матриксом, і судинною системою. Цей прийом дозволяє досягти щільності клітин у реакторі, подібної до такої у тканинах (до 10⁹ клітин/мл).

Відомі перфузійні системи культивування моношарових клітин на пористих капілярах, а також перфузійні системи культивування клітин під тиском з одночасною можливістю мікроскопічного дослідження клітин.

Перфузія поживного середовища використовується і при культивуванні клітин методом компактних гранул. Цей метод заснований на використанні одноманітно орієнтованих часток різних матеріалів у якості ростової поверхні для прикріплення клітин. За таким принципом побудована система зі скляним намистом, що являє собою ємність, заповнену скляними часточками діаметром 3-5 мм.

Перфузійне забезпечення клітин поживним середовищем і розчиненим газом використовується і у мембранних реакторах, матриксом яких слугують поліселективні волокна. При цьому аерація культуральної рідини відбувається через матеріал волокон. Таку систему культивування можна використовувати для одержання великих кількостей клітинного матеріалу завдяки можливості складання окремих конструктивних модулів у єдиний багатолотковий апарат.

Суспензійна культура є найбільш придатною для отримання великої кількості клітин, оскільки вирощування клітин в літровій судині принципово не відрізняється від вирощування в посудині об’ємом 1000 л. Різниця полягає лише в тім, до якого ступеню слід контролювати умови оточуючого середовища і якими засобами підтримувати потрібні для росту клітин фізіологічні умови. Збільшення об’єму суспензійних культур не потребує принципових змін конструкції посудин. Масштаб моношарових культур (для клітин, залежних від субстрату) досить важко збільшувати в традиційній системі, оскільки при такому збільшенні змінюється багато процесів і у відповідності до цього розвинені різні системи культивування великої кількості клітин в моношарі. При цьому головним завданням є збільшення площі поверхні для росту клітин як відносно середовища, так і відносно загального об’єму культури.