Диференцировка клітин

Ведення клітинних ліній потребує постійного збільшення кількості клітин. Тому зрозуміло, що вибір умов культивування, який проводили дослідники на протязі великого часу, був спрямований на забезпечення максимальної швидкості клітинної проліферації. Однак ці умови, як правило, були несприятливими для диференцировки клітин, при якій їх ріст суттєво обмежується або повністю пригнічується. До умов, що сприяють розмноженню, відноситься низька щільність клітин, низька концентрація іонів кальцію та наявність ростових факторів, таких як фактор росту епідермісу, фактор росту фібробластів та фактор росту, що синтезується тромбоцитами. З іншого боку, висока щільність клітин (вище за 10⁵ клітин/см²), високі концентрації іонів кальцію та присутність індукторів диференцировки (гормони, фактор визрівання глії, фактор росту нервів, ретиноїди та полярні розчинники, такі як диметилсульфоксид) сприяють припиненню клітинного поділу та індукують диференцировку клітин.

Роль сироватки, що додається у поживне середовище, у процесі диференцировки клітин, до кінця не встановлена. Її дія залежить від типу клітин і складу використаного середовища. Низькі концентрації сироватки сприяють диференцировці ряду клітин, але є клітини, де цей процес відбувається за високої концентрації сироватки. В останньому випадку активним началом виявляються молекули у складі сироватки, близько споріднені або ідентичні фактору пухлинного росту , що виділяється з тромбоцитів.

Велике значення має встановлення правильної полярності клітин та їх форми. Показано, що клітини, які ростуть на завису колагенового геля, омиваються поживним середовищем з усіх боків, а це дозволяє встановлювати правильну полярність відносно базальної мембрани, а також підтримувати правильну форму клітин завдяки пластичності субстрату.

Таким чином, для розмноження та диференцировки клітин потрібні різні умови культивування. У деяких дослідах потрібно чергування фази росту, результатом якої є нарощування клітинної маси, і фази визрівання, у якій клітини не ростуть, але у них експресуються ті або інші ознаки.

Вибір матеріалу

Головним фактором при виборі тканини або лінії клітин для подальшого дослідження є природа процесів, який буде вивчатися (або використовуватися) на цих клітинах. Вивчення таких загальних клітинних процесів, як синтез ДНК, проникненість мембран або визначення цитотоксичності може бути проведено на будь-яких типах клітин. Дослідження спеціалізованих клітинних функцій, таких як утворення мікротрубок, синтез антитіл або регуляція ферментів циклу сечовини, потребує використання особливих типів клітин, у якіх відбувається експресія цих функцій.

Спочатку тканинними культурами називали експланти цілих фрагментів тканин, вважаючи, що в цих фрагментах, принаймні частково, підтримується гістологічна цілісність. Тепер «культура тканин» перетворилося на загальне поняття, що включає в себе як органну культуру, у якій невеликі тканинні фрагменти або цілі ембріональні органи експлантуються зі збереженням тканинної архітектури, так і культуру клітин, коли клітини диспергуються механічно, ферментативно, або шляхом спонтанної міграції клітин з експлантату, і клітини розмножуються у вигляді суспензії або моношару клітин, прікріплених до субстрату.

При виборі того чи іншого типу культури слід брати до уваги такі обставини. Органна культура зберігає міжклітинні взаємодії, на протязі довгого періоду підтримує гістологічну та біохімічну диференцировку і після початкової травми експлантації та ряду некрозів залишається, як правило, у не ростучому стані рівноваги на протязі декількох днів і навіть тижнів. Ці культури не здатні до розмноження. При цьому кількісні дослідження органних культур ускладнюються внаслідок невеликих відмінностей у геометрії та складі експлантантів.

Культури клітин, напроти, як правило позбавлені структурної організації, втрачають характерну архітектуру і пов’язані з нею біохімічні ознаки. Вони звичайно не досягають стану рівноваги за відсутності спеціальних умов. Клітини в культурі розмножуються, що забезпечує отримання великої маси клітин та їх розділення на ідентичні паралелі. Культивовані клітини можуть бути охарактеризовані і певна клітинна популяція може бути збережена шляхом заморожування. Клітини ідентифікують за фенотиповими ознаками, шляхом вирощування у селективному середовищі, фізичним відбором, клонуванням або генотипово для отримання відносно однорідної лінії клітин.

Як правило, культури, отримані з ембріональних тваринних тканин характеризуються кращим виживанням та більш активним ростом в порівнянні з культурами з відповідних тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації клітин-попередниць, що реплікуються, або стовбурних клітин в ембріонах. Дорослі клітини володіють, як правило, зниженою проліферативною здатністю і більш високим вмістом спеціалізованих клітин, що не діляться, а також слабо дезагрегуючим позаклітинним матриксом. Отримання первинних культур клітин дорослих тканин та їх розмноження є більш складною задачею, і строк життя таких культур, як правило, невеликий.

Ембріональні тканини володіють багатьма практичними перевагами. Але слід зауважити, що у ряді випадків ці клітини відрізняються від дорослих клітин і немає певності, що вони визріють до відповідного дорослого типу, якщо це не буде підтверджено результатами аналізу.

В культурах клітин, отриманих з пухлин, можлива часткова диференцировка при збереженні здатності до проліферації. В багатьох дослідженнях використовується така здатність пухлинних клітин. Для вивчення диферецировки придатні клітини мишачої меланоми В16, гепатоми щурів з мінімальними відхиленнями, клітини нейробластом людини та гризунів.

Пухлинні тканини часто можуть пасуватися на сингенних хазяях (тобто тваринах, від яких взяли вихідну пухлину). Це забезпечує дешевий і простий спосіб отримання великої кількості клітин, хоча отримані популяції можуть бути недостатньо гомогенні. За відсутності природних хазяїв пухлини можна пасувати на безтимусних мишах. Цей метод є дещо складнішим, але володіє тими ж перевагами.

Багато інших відмінностей між нормальними та злоякісними клітинами аналогічні відмінностям між обмеженими та постійними лініями клітин.

Пухлинні клітини, переведені у культуру, або ж нормальні клітини, трансформовані в умовах in vitro у ряді випадків зберігають здатність синтезувати специфічні продукти. Наприклад, клітини пухлини гіпофізу у культурі синтезують аденокортикотропний гормон та гормон росту, клітини нейробластоми - фактор росту нервової тканини і ацетилхолінестеразу, і так далі. Тим не менш, для цих клітинних ліній залишається проблема злоякісності і нестабільності прояву фенотипових ознак.

Число прикладів успішного застосування такого підходу, внаслідок перелічених труднощів, поки що досить обмежене. Найбільш цікаві з них - отримання інтерферону та інсуліну. Однак слід відмітити, що вже у даний час технології, засновані на геноінженерних прийомах майже повністю витіснили пряме використання клітинних культур для крупномасштабного виробництва як інтерферону, так і інсуліну.

Свіжевиділені культури носять назву первинних культур до початку пасування або субкультивування. Клітини первинної культури зазвичай є гетерогенними і характеризуються невеликим рівнем проліферації. Але у таких клітинах найбільш повно представлені типи клітин тієї тканини, звідкіля вони були отримані, а також чітко спостерігається експресія ряду властивостей, притаманних даній тканині. Субкультивування забезпечує можливість продовження (в результаті субкультивування отримують лінії клітин), можливість клонування, дослідження і збереження клітин, а також отримання більш однорідних популяцій. При цьому в багатьох випадках субкультивування приводить до втрати спеціалізованих клітин та диференцировочних ознак, якщо не вживаються заходи для відбору спеціалізованих ліній і збереження диференцировочних властивостей.

Головною перевагою отримання клітинних ліній з первинних культур є напрацювання великої кількості стабільного матеріалу, придатного для тривалого використання.

Після декількох пересівів клітинна лінія або гине (обмежена лінія клітин), або «трансформується» і стає постійною клітинною лінією. При цьому не завжди ясно, чи виникають стовбурні клітини постійної культури у ході пасування, або вони передіснують в замаскованій формі в популяції клітин обмеженої лінії.

Клітинну масу для культивування отримують шляхом триптичної обробки відповідного органу. Останній розкладається на окремі клітини, які з урахуванням усіх обмежень, що викликані необхідністю додержання стерильності, переносять на поживне середовище для культивування. Поодинокі еукаріотичні клітини не здатні ділитися - вони швидко гинуть. З урахуванням цієї властивості при культивуванні створюють так званий шар поживних клітин. Для цього призначені для клонування клітини наносять на шар клітин, що втратили після опромінення здатність до поділу, але ще на деякий час зберегли метаболізм. Цього виявляється достатньо, щоб нанесені на цей шар клітини почали ділитися. Однак кількість клітин, що вступили у фазу поділу, віднесена до кількості клітин, які були нанесені спочатку на поживне середовище, завжди менше 100%. При додаванні у поживне середовище деяких речовин - так званих мітогенів, здатність клітин до поділу підвищується.

Серед мітогенів розрізняють групу речовин (фактори росту), що містяться у сироватці крові в дуже незначних кількостях. і мають властивості гормонів. Ідентифіковані такі з них, як фактор росту нервів, епідермісу, фібробластів та інші. Всі вони є білками з молекулярною масою від 6 до 130 тисяч дальтонів. Спектр дії їх більш широкий, ніж тільки стимуляція мітозу.

Крім факторів росту, мітогенна дія притаманна також речовинам під назвою лектини. Їх загальною властивістю є здатність специфічно зв’язувати залишки цукрів. У залежності від кількості ділянок, з якими вступають у взаємодію цукри, розрізняють двох- та полівалентні лектини. Головним джерелом лектинів є бобові (1,5 - 3% від усіх білків), хоча з бактерій, безхребетних та хребетних теж виділені ці речовини. Із сім’ян кліщовини отриманий рицин, з конвалії мечовидної - конканавалін А (КонА), із сім’ян фасолі - фітогемаглютинин (ФГА). При насиченні моносахаридами середовища, що містить лектини, останні втрачають здатність взаємодіяти з містячими вуглеводні рецепторами поверхні клітин. Це відбувається тому, що специфічні ділянки лектинів, з якими могли б вступати у реакцію вуглеводні рецептори клітинної стінки, вже зайняті раніш доданими моносахаридами.