ВИЧ и сопутствующие заболевания

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

в развитие, течение и исход многих заболеваний, включая вирусные, так же имеет немаловажное значение. ГИ не является исключением, при ней формируются все формы иммунного ответа. Однако до сих пор остается много неясных, спорных и неизученных вопросов в патогенезе формиро вания иммунного ответа при ГИ и, особенно, протекающей на фоне ВИЧ инфекции. Такое сочетание может вызывать выраженное разнона правленное изменение в иммунном ответе, приводящее к полиморфизму клинических проявлений.

Сформировавшийся иммунный ответ при ГИ может определять не только разнообразие клинических проявлений этого заболевания, но и персистенцию возбудителя. В свою очередь персистенция антигенов вируса может приводить к избыточному формированию иммунных ком плексов, оказывающих разнообразное влияние на сосудистое русло мно гих органов и систем, формируя иммунокомплексную патологию.

Репродукция герпесвирусов осуществляется в клетках иммунной системы, обусловливая гибель или снижение функциональной ак тивности этих клеток, что способствует длительной персистенции вирусной инфекции.

Результаты исследования иммунного статуса у наблюдаемых больных.

Каждую группу сравнивали с контрольной группой практически здо ровых людей в возрасте 20–29 лет. Как видно из данных, большинство показателей клеточного и гуморального иммунитета достоверно отлича ются от таковых у здоровых лиц.

Всем больным, госпитализированным в стационар, проводилась сим птоматическая, патогенетическая терапия и этиотропная терапия сопут ствующих заболеваний.

Все больные с клиническими проявлениями ГИ на фоне ВИЧ инфек ции получали противовирусную антигерпетическую терапию: ацикло вир, циклоферон, виферон и другие препараты.

Таким образом, изучение основных клинических показателей у больных с ВИЧ инфекцией и ГИ показало, что наибольшие изменения наблюдались при сочетанном течении вирусных заболеваний. Выявлены существенные нарушения в иммунном статусе у больных как при ВИЧ/СПИДе, так и при ГИ, при этом наиболее значимые изменения уровня циркулирующих им мунных комплексов были выявлены при ГИ на фоне ВИЧ инфекции.

60

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

Выводы

1.При наличии клинических проявлений ГИ у ВИЧ инфицированных больных отмечаются более выраженная симптоматика. В обеих груп пах с одинаковой частотой выявляются гемоконтактные гепатиты, но у ВИЧ инфицированных больных с проявлениями ГИ чаще выяв лялись урогенитальные инфекции.

2.У ВИЧ инфицированных больных с клиническими проявлениями ГИ выявлены существенные изменения большинства иммунологических показателей. Наиболее значимые изменения были отмечены при изу чении показателей клеточного иммунитета. Из показателей гумораль ного иммунитета достоверно отличались от аналогичных показателей здоровых лиц уровни IgA.

3.Клинико иммунологические изменения в наибольшей степени прояв лялись у пациентов с ГИ на фоне ВИЧ инфекции.

Данная работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и науч но педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы.

61

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

МИКРОСПОРИДИОЗ И ВИЧ ИНФЕКЦИЯ*

Микроспоридии (тип Microsporidia) — облигатные внутриклеточные паразиты, которых традиционно относили к простейшим (Protozoa), од нако в последние годы было показано, что микроспоридии родственны грибам. Тип Microsporidia включает в себя 143 рода, 7 из которых являют ся патогенными для человека: Encephalitozoon, Enterocytozoon, Trachipleistophora, Pleistophora, Anncalia, Vittaforma, Microsporidium. Боль шинство микроспоридий являются паразитами животных.

Микроспоридиозы — это группа заболеваний, вызываемых микроспо ридиями, характеризующихся преимущественно поражением желудоч но кишечного тракта с возникновением диареи, сопровождающейся раз витием синдрома мальабсорбции, часто приводящей к серьезной потере массы тела пациентов. Чаще всего микроспоридиозы рассматриваются как оппортунистическая инфекция при СПИДе. Однако в последнее вре мя появляется все больше данных о возникновении микроспоридиозов среди детей, лиц, перенесших трансплантацию органов, путешественни ков, и пожилых людей.

Впервые микроспоридиоз был описан в Америке в 1959 году. В настоя щее время заболеваемость микроспоридиозом описана в Италии, Фран ции, Германии, Испании, Бразилии, Чили, Австралии, Африке и состав ляет от 2 до 50%. В последнее время в странах, где обеспеченность АРВТ (антиретровирусная терапия) высока, уровень заболеваемости и летально сти от оппортунистических инфекций снизился. В регионах с недостаточ ной обеспеченностью препаратами оппортунистические инфекции зани мают ведущее место в причинах смертности больных с ВИЧ инфекцией.

Одним из основных осложнений ВИЧ инфекции в нашем регионе яв ляется «синдром истощения» при ВИЧ инфекции, который связывают с присоединением вторичных инфекций, поражающих желудочно кише чный тракт.

* — По материалам публикации: О.И.Соколова, А.В.Демьянов, Л.С.Боурс, Е.С.Дидье, С.О.Скарлатто, Ю.Я.Соколова, А.А.Яковлев. Микроспоридиоз у ВИЧ инфицированых пациентов // ВИЧ инфекция и иммуносупрессии.— 2011.— Т. 3—№ 3.— С. 63–70.

62

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

Несмотря на значение микроспоридий в развитии СПИДа, продемон стрированное работами зарубежных авторов, в России микроспоридии не диагностировали и их распространенность никогда ранее не изучалась. Это послужило основой для данного исследования, целью которого яви лась отработка методов диагностики микроспоридиозов, изучение рас пространенности возбудителя среди ВИЧ инфицированных пациентов в Санкт Петербурге, а также изучение роли микроспоридий в патогенезе диарейного синдрома у ВИЧ инфицированных пациентов.

Материалы и методы исследования. Клиническая часть работы выпол нена в Клинической инфекционной больнице им. С.П.Боткина в Санкт Петербурге. Материал был собран от 159 ВИЧ инфицированных пациен тов в возрасте от 20 до 60 лет мужского и женского полов. Было обследо вано 247 образцов кала методами световой и флюоресцентной микроско пии, а также методом ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации.

Из 159 пациентов у 9 проводилась ВААРТ. Шесть пациентов получали схему комбивир и стокрин, один пациент — комбивир и калетра, один — ставудин, эпивир и калетра и еще один — ставудин, ламивудин и вирамун.

От каждого пациента в течение 3 х дней собиралось до 3 образцов сту ла, которые были зафиксированы в 2,5% K2Cr2O7 и хранились при темпе ратуре 4°C или были заморожены при температуре 20° C и хранились та ким образом до проведения исследования. Также оценивались данные клинического анализа крови, иммунограмм, копрограмм, которые были проведены в течение 7 дней до или после забора кала на исследование. В это же время осуществлялся опрос пациентов и анализ историй болез ней для анализа жалоб и оценки уровня лихорадки и снижения массы те ла пациентов за последний год.

Световая и флюоресцентная микроскопия. Каждый образец стула сме шивали в соотношении 1:3 с фосфатным буфером, фильтровали через шприц с марлей и центрифугировали при 2000G в течение 2 минут. Оса док суспензировали в 50 мкл надосадочой жидкости. На предметное стек ло наносили 15 мкл суспензии и равномерно распределяли по стеклу, вы сушивали, фиксировали абсолютным метанолом, окрашивали флюорес центным красителем калькофлором (BactiDrop CalcofluorWhite, Lenexa, KS, США) в течение 1 мин, промывали водопроводной водой, и просмат

63

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

ривали под микроскопом Leica DM 2500, оснащенным насадкой для эпи флюоресценции, при увеличении 1000 X. Эти же стекла затем окрашива ли Голубым Трихромом (Modified Blue Trichrome Stain, REMEL, Lenexa, KS, США) и просматривали в светлом поле микроскопа.

Экстракция ДНК. ДНК была извлечена из фекальных образцов мето дом, описанным в работе L.Xiao и соавт. (2002) с незначительными моди фикациями. Из каждого образца отбирали 200 мкл кала и помещали 1,5 мл в эпендорф. Образец промывали три раза в фосфатном солевом бу фере (ФСБ, рН 7,2) центрифугированием при 10 000G в течение 10 мин. Осадок лизировали добавлением 66,6 мкл 1 М КОН и 18,6 мкл 1 M дити отреитола (DTT) и инкубировали при 65° С в течение 15 мин. Затем в ка ждую пробирку добавляли 8,6 мкл 25% HCl, 160 М Трис HCl (рН 8,3),

и250 мкл смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1), тща тельно перемешивали и центрифугировали при 8000 G в течение 5 мин. Верхнюю фазу каждого образца переносили в новую пробирку, содержа щую 1,0 мл ASL буфера из набора QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) и инкубировали при 80° С в течение 5 мин. После на гревания в пробирки добавляли по одной таблетке InhibitEX чтобы адсор бировать ПЦР ингибиторы. После этого образцы инкубировали 1 мин при комнатной температуре и центрифугировали в течение 5 мин при 20 000 G. 200–500 мкл надосадочной жидкости переносили в новую про бирку с равными объемами AL буфера и 100% этанола. После интенсив ного перемешивания, каждый образец помещали на аффинную колонку, центрифугировали в течение 1 мин при 20 000 G, дважды промывали AW1

иAW2 буферами, и освобождали от остатков воды с помощью дополни тельного центрифугирования. ДНК элюировали в 100 мкл ddH2O и хра нили при 70° C до использования в ПЦР.

Амплификация методом вложенного ПЦР (nested PCR). Мишенями для ПЦР был внутренний транскрибируемый спайсер (ITS) и фланкирующие регионы малой (SSU) и большой (LSU) субъединиц гена рибосомальной ДНК. Прямые праймеры первой и второй реакций (ПЦР1 и ПЦР2), MSP 1 и MSP 3, соответственно, связывались с 3’ областью SSU и узна вали широкий спектр видов микроспоридий, включая в виды рода Encephalitozoon и Е. bieneusi. Обратные праймеры, MSP 2B и MSP 4B, связывались с 5‘ областью LSU E. bieneusi, в то время как обратные прай

64

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

меры MSP 2A и MSP 4А узнавали Encephalitozoon spp., и некоторых дру гих микроспоридий, но не E. bieneusi. Реакции проводились в 25 μ л об щего объема с использованием ПЦР бус (Pure TaqTM Ready to goTM PCR beads (GE Healthcare, UK), растворенных в 21 мкл воды SuperQ. Ре акционная смесь ПЦР1 содержала 1 мкл каждого из праймеров MSP 1, MSP 2, MSP 3 и 1 мкл ДНК образца. Реакционная смесь ПЦР2 содержа ла 1 мкл каждого из MSP 3, MSP 4A, MSP 4B и 1 мкл реакционной сме си ПЦР1 (после проведения реакции). Ожидаемый размер ампликона для праймеров MSP 3 — MSP 4B (Е. bieneusi специфичных) был примерно 500 б.п., а для праймеров MSP 3 — MSP 4А (узнающих Encephalitozoon spp. и другие виды) размер ПЦР продукта был примерно 300 б.п. Ампли фикация проводилась с использованием термоцайклера фирмы Applied Systems. Циклы амплификации для ПЦР1 и ПЦР2 были одинаковые и включали в себя следующие этапы: начальная денатурация при 95°, 5 мин.; 36 циклов (денатурация при 95° C, 30 сек; отжиг при 55° C, 1 min: элонгация при 72° C, 2 мин); финальная элонгация при 72° C, 10 мин. В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из клеток MDK, инфицированных E. intestinalis, и из желчи макаки резус, содержащей Е. bieneusi. В качестве отрицательного контроля, вместо ДНК образца использовали SuperQ воду.

Сиквенирование продуктов ПЦР. Ампликоны нужного размера выреза ли из 2% агарозного геля. ДНК извлекали из геля с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, Madison, WI, USA) сог ласно инструкции производителя. ПЦР для сиквенирования проводи лась на термоцайклере системы Applied BioSystems BigDie Terminator (ver sion 3.1) и анализировали на сиквенаторе Beckman Coulter Seq 8000 DNA sequencer в Генной лаборатории Ветеринарной школы Университета штата Луизиана в Батон Руже (США). Для сиквенирования использовали праймеры MSP 3, МСП 4A, и MSP 4B; каждый ампликон прочитывался в двух направлениях.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки данных использовалась программа Statistica 6.0. При статистическом ана лизе определялись средние величины, стандартная ошибка средней арифметической, стандартное отклонение. При нормальном распределе нии уровни показателей описывались в виде «среднее значение ± стан

65

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

дартное отклонение», проверка гипотез о равенстве двух средних произ водилась с помощью T критерия Стъюдента. При ненормальном распре делении значений уровни показателей описывались в виде «медиана (Персентиль10 — Персентиль90)», а сравнение выборок проводили с по мощью непараметрического критерия Мана Уитни и теста Холмогорова Смирнова. Различия между группами считались достоверными при p<0,05. Для оценки взаимосвязи между качественными признаками ис пользовали точный тест Фишера для таблиц 2×2.

Результаты исследования. Из 158 обследованных пациентов у 30 (19%) было выявлено наличие микроспоридий. У двух пациентов наличие мик роспоридий было подтверждено только методом световой микроскопии с использованием обоих методов окрашивания образцов (калькофлором

иголубым трихромом). У этих пациентов идентификация вида возбудите ля не проводилась. У остальных 28 пациентов наличие микроспоридий бы ло выявлено методом ПЦР и секвенирования и/или световой микроско пии. Были обнаружены следующие виды микроспоридий: E. cuniculi у 2 па циентов, E. hellem у 1 пациента, E. intestinalis у 21 пациента, E. bieneusi у 2 па циентов и микст инфекция E. cuniculi and E. intestinalis у 1 пациента. Кроме того у 2 пациентов были выявлены неописанные ранее виды микроспори дий, генетические последовательности которых были отнесены к роду Microsporidium (род, включающий неописанные ранее виды микроспори дий), и помещены во Всемирный банк геномов (Gene bank).

Также стоит отметить, что среди 3 пациентов, у которых были выявле ны микроспоридии вида E. cuniculi, в двух случаях микроспоридии при надлежали к штамму 2, ранее описанному только у животных, а в од ном — к штамму 1, который чаще встречается у людей.

Демографические данные пациентов. Среди 30 пациентов, инфицирован ных микроспоридиями, было 12 (40%) женщин и 18 (60%) мужчин возрас том от 22 до 57 лет (32,6±8,9 лет). Возрастной и половой состав группы па циентов с микроспоридиозом достоверно не отличался от возрастного

иполового состава группы пациентов без микроспоридиоза. Уровень CD4+ Т лимфоцитов колебался от 4 до 647 кл/мкл (медиана 62; P10=12, P90=553) и достоверно не отличался от уровня CD4+ Т лимфоцитов у па циентов без микроспоридиоза. Однако с помощью точного теста Фишера, было показано, что среди пациентов с микроспоридиозом количество

66

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

больных с уровнем CD4+ Т лимфоцитов <100 кл/мкл был достоверно вы ше, чем у пациентов без микроспоридиоза (pдвухсторонний=0,02).

Проявления поражения желудочно=кишечного тракта. Микроскопичес кое исследование кала удалось провести 19 пациентам с микроспоридио зом и 92 пациентам без микроспоридиоза. Следует отметить, что бактери альные и другие инфекции (дизентерия, сальмонеллез, условно патоген ная флора, грибы рода Candida) ЖКТ (желудочно кишечного тракта) встречались в группе пациентов с микроспоридиозом и без микроспори диоза одинаково часто и не могли повлиять на результаты исследования. Сопутствующие инфекции ЖКТ были выявлены у 5(26,3%) пациентов с микроспоридиозом и 24 (26,1%) без микроспоридиоза.

При исследовании копрограмм было обнаружено, что у пациентов

смикроспоридиозом показатели копрограмм хуже, чем у пациентов без микроспоридиоза по следующим показателям: консистенция стула, по казатели нарушения всасывания в тонкой кишке.

Увсех 19 пациентов с микроспоридиозом стул оказался неоформленным: у 14 — кашицеобразный, у 5 — жидкий. В то же время у пациентов без мик роспоридиоза наличие неоформленного стула было обнаружено у 75 паци ентов. Эти различия оказались достоверными с вероятностью 96% (p=0,04).

Особенно обратило на себя внимание наличие нарушений переварива ния и всасывания питательных веществ у пациентов с микроспоридиозом. У всех 19 пациентов с микроспоридиозом выявлялись нарушения перева ривания и всасывания веществ. По этому показателю были выявлены до стоверные отличия от группы пациентов без микроспоридиоза, где нару шения переваривания и всасывания наблюдались у 69 пациентов (p=0,02). При этом нарушения переваривания и всасывания углеводов у пациентов

смикроспоридиозом встречались достоверно чаще, чем у пациентов без микроспоридиоза. В то же время нарушения всасывания и переваривания липидов и белков в группе пациентов с микроспоридиозом обнаружива лись с такой же частотой, как и в группе пациентов без микроспоридиоза.

Показатели поражения нижних отделов ЖКТ достоверно не различались в обеих группах. У пациентов с микроспоридиозом наличие слизи было обна ружено у 4 пациентов, наличие эритроцитов у 1 и лейкоцитов у 5 пациентов.

Чтобы охарактеризовать клиническую картину микроспоридиоза, бы ли собраны анамнез заболевания (длительность диареи, консистенция

67

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

ичастота стула), жалобы пациентов (боли в животе, тошнота, рвота, от рыжка, газообразвание), а также проанализированы данные объективно го осмотра об уровне лихорадки и наличии потери массы тела (менее 10%

иболее 10%).

Средняя длительность диареи у пациентов с микроспоридиозом соста вила 11 дней (P10=0, P90=24), и была достоверно выше, чем у пациентов без микроспоридиоза (р<0,05). Диарея продолжительностью больше 10 дней наблюдалась у 12 (40%) пациентов с микроспоридиозом и у 20 (22,2%) пациентов без микроспоридиоза.

У 26 (86,7%) пациентов с микроспоридиозом наблюдалось снижение массы тела. В то же время у пациентов без микроспоридиоза снижение массы тела наблюдалось только у 63 (50%) пациентов. Эти различия ока зались достверными (p=0,0001). Из 26 снизивших вес пациентов с микро споридиозом у 7 (26,9%) наблюдалось снижение массы тела менее 10%, а у 19 (73%) более 10%. В то же время, среди пациентов без микроспори диоза снижение массы тела менее 10% наблюдалось у 32 (50,8%) пациен тов, а более 10% у 31 (49,2%) пациента. При анализе данных было показа но, что пациенты с микроспоридиозом достоверно чаще теряют более 10% массы тела, чем пациенты без микроспоридиоза (p=0,043).

Частота стула, температура тела у пациентов с микроспоридиозом не отличалась от этих показателей в группе пациентов без микроспоридиоза.

Никаких достоверных различий в частоте выявления жалоб: тошноты, рвоты, болей в животе, повышенного газообразования у пациентов с ми кроспоридиозом и без микроспоридиоза выявлено не было.

Эпидемиологический анамнез. Для выявления возможных факторов ри ска развития микроспоридиоза были проанализированы следующие дан ные анамнеза жизни: лицо без места жительства, лицо, употребляющее инъекционные наркотики, мужчина, имеющий половые отношения

смужчиной, лицо, злоупотребляющее алкоголем, иногородний, владелец домашних питомцев.

Злоупотребление алкоголем встречалось в группе пациентов с микро споридиозом достоверно чаще, чем у пациентов без микроспоридиоза (p=0,02). Другие особенности анамнеза жизни встречались у пациентов

смикроспоридиозом и без него одинаково часто.

68

ВИЧ инфекция, вторичные и сопутствующие заболевания 2014

При проведении многофакторного анализа влияния вышеописанных факторов на возникновение микроспоридиоза было показано, что наи большее влияние на возникновение микроспоридиоза оказывают фактор «злоупторебление алкоголем» и фактор бездомности человека.

Обсуждение. Частота встречаемости микроспоридиозов до начала эры ВААРТ в развитых странах колебалась от 5% до 50%, в среднем составляя 15%. Последнее десятилетие в развитых странах с высокой доступностью АРВТ частота микроспоридиозов, как и других оппортунистических ин фекций, снизилась. Однако в странах с недостаточной доступностью ВА АРТ частота встречаемости оппортунистических инфекций, включая мик роспоридиозы, остается такой же, как и в период до появления АРВТ. На чиная с 2000 года, случаи выявления микроспоридиозов регулярно регист рируются на разных континентах. На территории Южной Америки они от мечены: в Бразилии, встречаемость 27,5% и Венесуэле, 17,4%. На Афри канском континенте микроспоридиозы зарегистрированы: в Камеруне, встречаемость 5,2%; Эфиопии, встречаемость 16%; Гвинеи Бисау, 11%; Тунисе, 11,8–20%; Уганде, 77% инфицированных микроспоридиозом де тей; Нигере, 10,5%, Южной Африке, 21,6%. В Южной Азии микроспори диозы описаны из Индии, 1–26,7%; Таиланда, 81,2%; Вьетнама, 9,5%. Да же в некоторых странах Европы уровень заболевания достаточно высок, например, в Португалии, 42,7%.

В Санкт Петербурге уровень зараженности микроспоридиозом ВИЧ инфицированных пациентов по нашим данным составляет 18,9% и сопо ставим с уровнем данного заболевания в развивающихся странах или уровнем заболеваемости в эпоху до широкого распространения АРВТ.

Наиболее часто встречающимся видом микроспоридий у людей явля ется E. bieneusi, поэтому столь частое обнаружение E. intestinalis в наших образцах вызывает интерес. Обыкновенно E. intestinalis паразитирует на домашних животных, в первую очередь на собаках и грызунах. В редких случаях E. intestinalis поражает желудочно кишечный тракт человека. Этот вид иногда вызывает диссеминированные микроспоридиозы.

Также выявление в образцах E. cuniculi штамма 2 заслуживает внима ния: ранее для человека были описаны только штаммы 1 и 3. Штамм 2 выявляли лишь у крыс, мышей и птиц.

69