Контрольні питання.

1. Які умови необхідно створювати для вирощування мікроорганізмів?

2. Яким загальним вимогам повинне відповідати будь-яке поживне середовище?

3. Як класифікуються поживні середовища?

4. Охарактеризуйте природні та штучні поживні середовища ?

5. Що таке елективні та диференційно-діагностичні середовища ?

6. Дати класифікацію поживних середовищ за консистенцією.

7. Які стандартні середовища використовують для вирощування бактерій, дріжджів, пліснявих грибів?

8. Як готують плотні середовища?

9. Що таке желатин і агар ?

10. Яка температура плавлення та застигання середовищ з агаром та желатином?

Лабораторна робота4.

Стерилізація. Методи стерилізації.

Підготовка посуду, інструментів та матеріалів для стерилізації.

Завдання.

Студенту необхідно ознайомитись з методами стерилізації та апаратурою для стерилізації.

Повне звільнення будь-якого матеріалу від живих мікроорганізмів та їх перебування у спокої шляхом високої температурної обробки (100С)називається стерилізацією. Досягається це в автоклавах, де підтримується більше 100С за рахунок підвищеного тиску. Стерилізація проводиться з метою знищення мікроорганізмів та їх спор.

Пастеризація – це знищення у дослідному матеріалі тільки вегетативних клітин мікроорганізмів. З цією метою продукт або дослідний матеріал піддають тепловій обробці при температурі 75 – 80 ⁰С протягом 5 – 6 хвилин. Пастеризують частіше всього продукти харчування (молоко, соки, пиво, вина). При пастеризації гинуть спори грибів, вегетативні клітини бактерій, у тому числі і патогенних, тоді як бактеріальні ендоспори залишаються життєздатними. Під час зберігання продуктів їх пророщуванню перешкоджають низькі значення рН, високі концентрації цукру, відсутність кисню та деяких інші фактори.

Способи стерилізації.

Стерилізація під дією високих температур. Найбільш часто для стерилізації використовують високі температури, які викликають загибель мікроорганізмів. Під дією високих температур стерилізують бактеріологічні петлі, ігли, кінчики пінцетів, пробні свердла та деякі інші металеві предмети.

Стерилізація кип’ятінням. Цю стерилізацію проводять у стерилізаторі на маленькому вогні для того, щоб минути розбризкування рідини. Початок стерилізації починається з моменту закипання води у стерилізаторі. По закінченню кип’ятіння, воду зливають та інструменти беруть стерильним пінцетом. Кип’ятінням стерилізують шприци ( у розібраному виді), металеві інструменти ( ножиці, скальпелі, пінцети), гумові рукавички та пробки, деякі інші предмети. Інструменти, які мають металеві частини стерилізують у 2% розчині гідрокарбонату натрію, який попереджує з’явлення іржі.

Стерилізація сухим жаром. Здійснюється у сушильних шафах. Максимальна температура досягає 200 ⁰С. Гарячим повітрям стерилізують скляний посуд ( пробірки, піпетки, стакани, колби, шприци та інше). Перед стерилізацією посуд миють, сушать та загортають у папір. Під час стерилізації спори бактерій витримують високу температуру на протязі тривалого часу.

Звична тривалість стерилізації при температурі 160 ⁰С – 2 години, при 165 ⁰С – 1 година, при 180 ⁰С – 40 хвилин, а при 200 ⁰С – 10-15 хвилин. Слід мати на увазі, що при температурі 170 ⁰С папір та вата жовтіють, а при більш високих температурах обвуглюються. По закінченні стерилізації сушильну шафу вимикають, але дверці її не відкривають до повного охолодження, через те, що холодне повітря всередині шкапи може визвати утворення тріщин на гарячому посуді.

Стерилізація вологим жаром (текучим паром). Стерилізація текучим паром проводиться в апараті Коха при відкритому випускному крані. Апарат Коха являє собою металевий порожнистий циліндр з подвійним дном та електронагрівальним приладом. Простір між верхньою та нижньою пластинками дна заповнюється на 2/3 водою. В кришці апарату вмонтовано термометр і є отвір для виходу пару. В апараті Коха стерилізують головним чином живильні середовища, властивості яких змінюються при температурах вище 100 ⁰С.

Обробку матеріалу текучим паром використовують для проведення дрібної стерилізації. При цьому матеріал, більш за все живильні середовища, піддаються трьох, чотирьохкратній обробці вологим жаром на протязі однієї години при температурі 56 – 75 ⁰С з інтервалами 24 години, на протязі яких підтримується температура, сприятлива для проростання спор. Пророслі зі спор вегетативні клітини швидко гинуть при черговому нагріванні матеріалу.

Стерилізація вологим жаром під тиском (в автоклаві). В основі способу лежить прогрівання будь-якого матеріалу насиченим паром під тиском вище атмосферного. Звісно, що температура насиченого пара залежить від тиску (з підвищенням тиску його температура зростає), це дозволяє стерилізувати при температурі 100 ⁰С та вище, не допускаючи кипіння й випарювання та розприскування. Тривалість стерилізації паром під тиском залежить від хімічного складу матеріалу, видів мікробів, які знаходяться в ньому, а також від об’єму (теплоємність) судин, у яких проводять стерилізацію. Умови підвищеного тиску насиченого пару роблять у спеціальних товстостінних апаратах, які герметично зачиняються – автоклавах. Вони бувають різної конструкції, але принципова схема у них одна. Це дві камери – велика (робоча або стерилізаційна) та маленька (для води), з’єднані між собою трубопроводом з вентилем. Водянопарова камера з’єднана також з зовнішнім середовищем трубкою з водомірним склом, краном та воронкою, крізь яку міститься матеріал, обладнана краном для виходу повітря, манометром для визначення тиску пару та запобіжним клапаном для виходу пару при надмірному підвищенні тиску.

Стерилізація фільтруванням. Багато компонентів рідинних середовищ термолабільні та швидко руйнуються під впливом високих температур. Тому рідинні живильні середовища та інші рідинні матеріали зручніше (значно скоріше та ефективніше дрібної стерилізації) стерилізувати фільтруванням. Вперше стерилізація рідин фільтруванням була проведена Шамберланом, учнем Л.Пастера. Він виготував фарфоровий фільтр, який являє собою порожнистий циліндр, зачинений з одного кінця, який нагадує свічу – свіча Шамберлана. Фільтр затримує найбільш дрібніші бактерії з усіх відомих. Для стерилізації питної води використовують фільтр Баркенфельда. Стінки свіч Шамберлана та Баркенфельда складаються з глинозему, фарфору або кізельгуру. Ці матеріали несуть позитивний заряд, у той час, як бактерії заряджені негативно. Механізм фільтрації через свічки, які замикаються, має характер адсорбції. Також до адсорбції відносяться фільтри, які виповнені з глини, азбесту та деяких інших матеріалів.

В теперішній час у мікробіологічній практиці використовують азбестові та скляні фільтри. Азбестові фільтри являють собою пластинки товщиною 3-5 мм, діаметром 35-140 мм. Перед використанням азбестові пластинки монтують у спеціальному фільтрувальному апараті – прилад Зейтца, який складається з 2-х частин: металевого або скляного циліндру та нижній частини апарату, їх з’єднують гвинтами або затискачами. На трубку нижньої частини вдягається гумова пробка, за допомогою якої він угвинчується в колбу Бунзена. Виготовлений прилад Зейтца обмотують у папір та стерилізують в автоклаві. Рідину, яку стерилізують, наливають у циліндр та з’єднують боковий відросток колби Бунзена з вакуум-насосом. У результаті утворення різниці тиску рідина проходить через азбестовий фільтр у приємник (колбу). У апарат Зейтца монтуються також стерилізуючі скляні та мембранні фільтри. Мембранні фільтри виготовляють з ацетату целюлози або нітроцелюлози. Фільтри з нітроцелюлози являють собою тісне переплетіння нітроцелюлозних волокон.

Внаслідок малого розміру пор та високого поверхневого натягнення, яке з’являється у зіткненні рідини з нітроцелюлозними фільтрами, використовують тиск або розріджування. Щоб зменшити гідрофобність фільтрів до них додають детергент (поверхньо активна речовина), щоб уникнути висушування обробляють гліцерином. Мембранні фільтри безпосередньо перед використанням стерилізують кип’ятінням.

Стерилізація опромінюванням. На клітини бактерій згубний ефект чинять ультрафіолетові, рентгенівські, гама-, альфа-, бета-проміння та нейтрони. Бактерицидні лампи використовують для часткової стерилізації поверхнього шару об’єктів та повітря приміщень (операційні, хірургічні відділення, пологові будинки, бокси та інші). Застосування ультрафіолетових променів обмежується з-за малої здібності проникнення . Вегетативні форми бактерій більш чутливі до ультрафіолетового опромінювання, ніж спори, які у 3-10 разів більш стійкі. Слід пам’ятати, що ультрафіолетові промені викликають гостре запалення роговиці очей. Тому необхідно стежити, щоб не прямі, не відбиті промені не потрапляли до очей, і застосовувати при роботі з кварцовими лампами захисні окуляри.

Хімічна стерилізація (дезинфекція). Дезинфекція являє собою процес пригнічення або руйнування за допомогою хімічних агентів патогенних мікроорганізмів, які знаходяться на неживих об’єктах або поверхнях. Дезинфекція проводиться у тих випадках, коли неможливо застосувати дезинфекцію паром або іншими фізичними методами, наприклад, коли мають справу з великими просторами, великими поверхнями або стаціонарним обладнанням.