Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

2.Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3.Амфітрихи– поодинокіабопучкиджгутиківнаобохкінцяхбактерій(спірили);

4.Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник черевного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При

прямихметодахджгутикизабарвлюютьбарвникамиабосолямиметалів. Обов’язково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла або заліза, що призводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають видимимипідсвітловиммікроскопом. Допрямихметодіввиявленняджгутиківвідносяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надавленій краплі за допомогоюсвітлової, темнопольної, фазово-контрастної та аноптральної мікроскопії.

Забарвленняджгутиків– одназнайтонших, складнихівимогливихбактеріоскопічнихметодик. Запропонованобагатоскладнихметодівїхфарбування: Леффлера, Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єттітаін. Найнадійнішимізнихєметод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливоюумовоюдляуспішного забарвлення є виготовлення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежирених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і вносятьїїв5-6 млводопровідноїводи, не емульгуючи, азалишаючипетлюдотих пір, покибактеріїсамірозійдутьсяврідині. Пастерівськоюпіпеткоюзтонковідтягнутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1.Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл 20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірчанокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання, перед використанням обов’язково фільтрують.

2.КонцентрованийфеноловийфуксинЦиля, наполовинурозведенийводоюі

профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протягом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави. Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-ко- ричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчином, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну 10 г, дистильованої води100 мл; розчин 2 – насичений спиртовий розчингенціана фіолетового.

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препа- рат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають водою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

Мікроскопічне дослідження живих мікробів

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надавленої й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Перевагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді, тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супроводжується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користу- ютьсявпрактичнихлабораторіяхпридиференціально-діагностичномувизначенні видів збудників.

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно рухаються, важковиявлятидеталіструктури. Притакомудослідженніможнаматилише загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку структуру їх клітин краще, ніж у забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазовоконтрастної та аноптральної мікроскопії.

Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небезпечна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно обов’язково занурювати препарати в дезінфікуючий розчин.

Надавлена крапля. Насередину предметного скла бактеріологічною петлею або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють фізіологічнимрозчином, оскількинаявністьвеликоїкількостімікробнихтілуполі зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесену краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінцетом, щоб у надавленій краплі не з’являлись бульбашки повітря. Для цього покрівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями. Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не виступаєзакраїпокрівногоскельця. Якщовонавиступає, зайвуїїчастинувідсмоктують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого папірзанурюютьудезінфікуючийрозчин. Недоліком надавленоїкраплієїїшвидке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла заздалегідь змащують вазеліном.

Висячакрапля– методмікроскопічногодослідженняживихмікроорганізмів, розроблений Р. Кохом в 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмно-

ження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми, явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо. Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпростіших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури, вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої суспензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежиреного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо змащуютьвазеліном, обережнонакладаютьнапокрівнескельце, слідкуючи, щобкраплякультуризнаходиласьвцентрізаглиблини, ішвидкоперевертаютьйого. Крапля повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом довгого часу (рис. 14).

Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій крапляхпроводитьсязадопомогоюсильнихсухихабоімерсійнихсистемприопущеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спочатку при малому збільшенні (× 8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в дещозатемненому полізору. Поодинбікцьогокраюєбагатодрібнесенькихкраплинок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По другий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший сухий (× 40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (× 90). Трохи відкривають діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії проходятьзоднаковоюшвидкістюзначнувіддаль, часомчерезусеполезору, роблячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять монотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й безладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молекулярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно коливаються між двома близькими точками, ніби “танцюють” на місці.

Одним ізсуттєвих недоліків методувисячої краплієслабкачіткістьконтурів

ми в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів.

Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи висячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і толуїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них запропонували Пєшков і Фонбрюн.

Ш-подібна камера Пєшкова. На предметне скло наливають шар розтопленого агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають дві канавки і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату. Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розвиток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за допомогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики попередньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру, щобвипаруватиконденсаційнувологу, іпастерівськоюпіпеткоюнегайнозаливають її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

За допомогою камер Пєшкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни клітиннихструктурприрозмноженнібактерійіпроводитиїхцейтрафернукінозйомку особливо при використанні фазово-контрастної й аноптральної мікроскопії.

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгу-

тиків, дослідженнязадопомогоюнадавленоїтависячоїкрапель, рухливістьмікроорганізмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього досліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середовища. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рухливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщині живильного середовища.

Розділ 4

ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологіямікроорганізмівякокремийрозділмікробіологіївивчаєбіохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби. Адже бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються різноманітні біохімічні перетворення. Вонизумовлюютьріст, розмноження, продукціюферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію функціональної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовнішнього середовища.

Культивуваннямікроорганізмів

Вимоги до живильних середовищ. Для вирощування бактерій у лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

У першу чергу, бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (м’ясо яловиче, риба, м’ясо-кісткова мука, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовуватийзамінниким’яса– плаценту, кров’янізгустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і вода, а також ростові фактори (вітаміни групи В, ферменти). Універсальним джереломїхслужатьекстрактизбілківтваринногойрослинногопоходження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати – кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, шматочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допускаєтьсязастосуванняречовин, якіусуваютьдіюінгібіторівростуітоксиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності та рівень окисно-відновного потенціалу (Еh), який для аеробних мікроорганізмів досягає понад 0,08 В, а для анеробних бактерій коливається в межах 0,12-0,60 В.

Середовища повинні мати певну в’язкість, густину, мати певну вологість (до 20 % води), бути ізотонічними, прозорими й обов’язково стерильними.

Основніживильнісередовища. Численніпотребимікроорганізмівзумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо

перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовольнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовуютьзгорнутусироватку, молоко, яйця, м’язовутканину. Штучні середовищастворюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів. Їх використовують в основному для експериментального вивчення окремих ланок метаболізму бактерій.

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 % та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, якийдобуваютьзморськихводоростей. Складаєтьсявінзполісахаридів(70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин. Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи, надає середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Залежновідпотреббактеріологівживильнісередовищаподіляютьсянап’ять основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясо-пеп- тонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністюживильнихречовинвонипридатнідлякультивуваннябагатьохвидівбактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, сироватковийагари, сироватковийбульйон, асцитичнийбульйон, асцит-агартаінші.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для холерних вібріонів, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії.

Четверта група селективні середовища, які завдяки додаванню певних компонентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. Так, середовище Мюллера єселективнимдлятифо-паратифознихбактерій, фуразолідоно-твіновийагар– для коринебактерій і мікрококів. Додавання антибіотиків до складу середовищ робить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ятагрупа– диференціально–діагностичнісередовища. Цевеликагрупасередовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Всеширшезастосуваннявмікробіологічнихлабораторіяхзнаходятьчисленні комерційні тест-системи для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів, виготов-

лені на основі різноманітних диференційно-діагностичних середовищ. В одному варіанті виконання вони вносяться в спеціальні полістиролові або інші планшети тависушуютьсядлявидаленняводи. ДонихналежатьсистемиАРІ-20 дляідентифікації стафілококів, коринебактерій, ентеробактерій, анаеробних мікробів, Enterotest 1 і 2, російська система ПБД (пластина біохімічна диференційна) для ідентифікації ентеробактерій (див.вкл., рис. 29). Непогано зарекомендували себе тест-системи Roche та інші.

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюючих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяютьодночасно дослідити широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки. Комп’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оцінити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ вхо-

дять переважнонатуральні тваринніаборослинніпродукти і компоненти– м’ясо, рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готують спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання живильнихсередовищ. Крімцього, вживильнісередовищадодаютьрізнінеорганічні солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду натрію складає 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, інші солі додаються із розрахунку0,001 г/л. Унеобхідних випадках доскладу вводятьвуглеводи (цукри, багатоатомніспирти), амінокислотивконцентрації0,5-1,0 %, атакожвітаміни(до

0,001 мг/мл).

Длязабезпеченнянеобхідноїгустинисередовищавикористовуютьагар-агар, якийодержуютьзморськихводоростей. Вінєзручнимінеобхіднимкомпонентом середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворюючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С. Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки, кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовленняживильнихсередовищєскладнимдинамічнимпроцесом, який потребуєувагибактеріолога. Цейпроцесскладаєтьсяздекількохосновнихетапів. Спочаткудодистильованоїводизгіднозпрописом додаютьнеобхіднісухі компоненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’язково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра,

або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилізації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, колби, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками. Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так, середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при температурі112 °Саботекучоюпароюпритемпературі100 °Сдробно. Середовищабез вуглеводівможнастерилізувативавтоклавіпри115-120 °Спротягом20 хв. Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням черезбактеріальніфільтри, абоїхдодаютьготовим устерильнесередовище. Контроль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимоприкладивиготовленнядеякихпростихживильнихсередовищ, які найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути основою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку попередньоочищаютьвіджиру, фасцій, сухожилківтощо, розрізаютьнадрібнішматки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи накип, апотімвідстоюють. Відділяютьрідинувідфаршу, фільтруютьчерезфільтрувальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура 120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за допомогою20 % розчинуNaOH ікип’ятять30-40 хв, постійноперемішуючи. Бульйон фільтруютьчерезпаперовийабополотнянийфільтри, розливаютьуфлакони, пробірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С протягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). До м’ясо-пептонного бульйону додають дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною. Оскільки ці середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед застосуванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додають

стерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тварини. ФлаконизагаромретельноперемішуютьірозливаютьучашкиПетрі, слідкуючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’яса одержативдекількаразівбільшебульйону. Уцьомусередовищіміститьсявеликакількість амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стабільним є значення активної реакції середовища.

Длявиготовлення перевару берутьодинкілограмм’яса безсухожилківіжиру, порізанийнадрібнішматкирозміромдо1-2 см, занурюютьукаструлюзподвійним об’ємомводи, якакипить, ікип’ятять15-20 хв, поким’ясонестанесірим, щосвідчить про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У рідині, яказалишилась, встановлюютьрН8,0, опускаютьтудифаршіохолоджують до40 °С. Потімдодають10 % (дооб’ємурідини) свіжоїпідшлунковоїзалози, попередньоочищеноївідсполучноїтканини, жируідвічіпропускаютьчерезм’ясорубку. Замістьзалозивикористовуютьсухийпрепаратпанкреатину(0,5 %). Одержанусуміш ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недоброякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у великі бутлі, заповнюючи їхна1/3. Додаютьдо3 % хлороформу, закривають посуд резиновимикоркамитаінтенсивнозбовтуютьдляперемішуваннярідин. Надлишок парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища, встановлюючийогона7,4-7,6. Отриманусумішзалишаютьприкімнатнійтемпературінастрокдо16 днів. Протягомперших3-4 днівщоденноперевіряютьікоригують рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За 1-2 днідозакінченняциклуперетравлюваннязбовтуваннясередовищаприпиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка набуває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду. Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою пробизбромноюводою(до3-4 млфільтратудодають3-4 краплібромноїводи). За наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожевофіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амінний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до 100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду натріюта0,2 % однозаміщеногофосфорнокислогонатрію. ДоводятьрНдо7,4-7,6, розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецептурою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартними сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промисловість. Такі середовища дозволяютьсуттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

Основні методи стерилізації

Головнийнапрямуборотьбізінфекційнимихворобами– профілактичний. У зв’язку з цим у діяльності лікувальних закладів велике значення має попередженняпопаданнязбудниківзахворюваньворганізмлюдиниабоіншіоб’єкти. Цепроводитьсядобрерозробленимийапробованимиметодамимікробноїдеконтамінації. Основні з них – стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, матеріалах, у живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, перев’язочний і шовний матеріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторіях – живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому перед стерилізацією необхідно вміти підготувати інструменти, посуд, пробірки, піпетки, перев’язочний матеріал та інше.

Інструменти обробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж розчині 0,5-1 хв, прополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загортають у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилізаційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця затикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закривають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою високої температури. ЕфективністьтакоїстерилізаціїпринагріванніхарактеризуєтьсяпоказникомD – часом, який необхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення популяціїбактерій(на90 %). Йоговеличинавимірюється, якправило, ухвилинах.

Прожарюваннявполум’їпальника– швидкиййабсолютнонадійнийспосіб. Ним стерилізують бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця.

Кип’ятіння протягом 40 хв у спеціальних стерилізаторах використовують дляобробкихірургічнихінструментів, шприців, голок, гумовихтрубок. Дляпідвищеннятемпературикипінняйусуненняжорсткостіводидодають1 % бікарбонату