Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Реакція аглютинації латекса (РАЛ) за своїм механізмом аналогічна РНГА, вякій берутьучастьеритроцити, сенсибілізовані антигенамиабоантитілами. Для постановки РАЛ використовують сенсибілізовані частинки полістиролового латексадіаметром 0,5-1,2 мкм, яківприсутностігомологічного імунологічного реагенту (антигену або антитіла) склеюються. Ця реакція відбувається досить швидко (2-7 хв), що дозволяє застосовувати її як експрес-метод виявлення антигенів і антитіл.

Навантаженіантитіламичасточкилатексушироковикористовуютьдлявиявлення антигенів вірусів і бактерій. Наприклад, антигени стрептококів у мазках із зіву можна виявити вже через 10-60 хв. Збудників, які викликають запалення моз-

ковихоболонок (H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, C. neoformans), мож-

на безпосередньо виявити протягом 15 хв. Латекс-аглютинація широко вживається для ідентифікації антигенів ротавірусів, герпесвірусів тощо. Чутливість цих тестів сягає понад 90 %, а специфічність – 97-99 %. РАЛ використовують також для ідентифікації деяких бактерій (наприклад групи Streptococcus за Ленсфільд, групи Salmonella та інші.). Останнім часом у деяких латекс – системах замість поліклональних сироваток використовують частинки латексу, навантажені моноклональними антитілами (наприклад, для виявлення S. agalactiae).

Навантажуючи латекс антигенами, можна визначати наявність антитіл у сироватці хворого. Таку модифікацію РАЛ використовують для виявлення протигрипозних, протикраснушних, протикорових антитіл тощо.

Реакцію аглютинації латексу можна проводити на склі або рівній пластмасовій пластинці темного кольору, додаючи до 1-2 крапель кожного розведення сироватки по 1 краплі латексного діагностикуму. Залежно від досліджуваного матеріалу, величини частинок латексу та активності діагностикуму облік результатів можна проводити через 1-10 хв після змішування інгредієнтів.

ліном протягом 20-120 хв. Після фіксації стафілококи промивають 4 рази ізотонічним розчином хлориду натрію і знову готують 10 % суспензію, яку прогрівають протягом 1 години при температурі 80 °С. Перед зберіганням до суспензії стафілококів додають мертиолят до кінцевої концентрації 1: 10000.

Для сенсибілізації в 10 % суспензію фіксованих стафілококів вносять рівний об’єм імунної сироватки кролика або її гамаглобулінової фракції у відповідному розведенні від 1:10 до 1:20. Стафілококи сенсибілізують імуноглобулінами впродовж 15-30 хв при температурі 20-30 °С, після чого промивають ізотонічним розчином. Готують 0,5-5,0 % суспензію, яку консервують азидомнатрію і зберігають у холодильнику при температурі 4 °С.

Зазвичай, реакціюкоаглютинації ставлять на скляних пластинках, змішуючи рівні об’єми (1-2 краплі) досліджуваного матеріалу (кров, сеча, слина, фільтрати фекалій та ін.) і стафілококового діагностикуму. Суміш ретельно перемішують і через2-5 хвнатемномуфонівраховуютьрезультати. Використаннятемногофону – необхідна умова чіткої реєстрації реакції КОА, тому що при спостереженні за її результатамипризвичайномуосвітленнілишенатемномуфонічіткобудепроглядатись дрібнозерниста аглютинація стафілококів.

Кожендослідповиненсупроводжуватисьдекількоманегативнимиконтролями: 1) стафілококи, сенсибілізовані нормальною сироваткою + досліджуваний матеріал; 2) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + матеріал, який не містить збудника; 3) стафілококовий коаглютинуючий діагностикум + фосфатно-

буферний розчин; 4) дослідуваний матеріал + фосфатно-буферний розчин. РеакціяКОАшироковикористовуєтьсядлявиявленняантигеніврізнихстреп-

тококів, N. meningitidis i N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. pneumoniae, шигел, саль-

монел тощо.

На відміну від бактерій, які часто досліджують у чистій культурі, віруси завжди виявляють в якомусь біологічному матеріалі. Тому, щоб попередити неспецифічні реакції, необхідна адсорбція суспензією стафілокока матеріалу, в якому можуть міститись IgG (кров, фекалії). Для цього змішують рівні об’єми 10 % зависістафілококового реагенту і досліджуваноговірусного матеріалу. Суміш інкубують протягом 30 хв при 37 °С, центрифугують і надосадову рідину використовують для подальшої роботи для виявлення в ній збудників хвороби.

Методзуспіхомвикористовуєтьсядляідентифікаціївірусівгрипу, параміксовірусів, ротавірусів, вірусів гепатиту В тощо.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА) набула широкого розповсю-

дження для діагностики вірусних інфекцій. Її можна застосовувати як для серологічної ідентифікації вірусів, так і для серологічної діагностики. Гемаглютинація– цефеноменсклеюванняеритроцитівпідвпливомвірусів. Деяківірусимають на своїй оболонці рецептори, комплементарні рецепторам поверхні еритроцитів певних тварин, і при додаванні до суспензії вірусів еритроцитів, останні склеюються. Наприклад, вірус грипу аглютинує еритроцити курей, вірус кліщового енцефаліту – еритроцити гусей. Таким чином, у випадку гемаглютинації можна зробити висновок про наявність вірусу в досліджуваному матеріалі. Проте ця

реакція не імунологічна, тому що в ній не бере участі основна система – антиген

іантитіло.

Утой же час реакція гальмування гемаглютинації належить до серологічних реакцій імунітету. У РГГА специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з вірусоміблокуючиповерхневірецептори, позбавляютьйогоздатностісклеюватиеритроцити (рис. 47).

Рис. 47. Схема реакції гальмування гемаглютинації.

Для постановки РГГА в лунках полістиролових планшет готують послідовні розведеннясироваткивоб’ємі0,25 млізмішуютьїхзаналогічноюкількістювірусовмістного матеріалу. Суміш ставлять у термостат при 37 °С на 30 хв, після чого в кожну лунку додають по 0,5 мл 1-2 % зависі еритроцитів (табл. 20).

Таблиця 20

Постановка РГГА для серологічної діагностики вірусних інфекцій

Обов’язкові два контролі: контроль сироватки і контроль вірусу. Облік про- водятьпісляповторного30-хвилинногоперебуванняреагентівутермостаті. Якщо досліджуванасироваткаміститьантитіладоданоговірусу, вонайогонейтралізує, і феномен гемаглютинації еритроцитів не настає (позитивна РГГА).

Реакцію нейтралізації (РН) в лабораторній практиці використовують досить часто. Вона має декілька варіантів. З одного боку її все ширше ставлять для нейтралізації вірусів, з другого – для нейтралізації бактерійних екзотоксинів.

Реакція нейтралізації вірусів. В основі цієї реакції лежить здатність специфічних антитіл міцно зв’язуватись з вірусами. В результаті віруси не можуть адсорбуватись на чутливих клітинах і розмножуватись в них.

Для постановки реакції необхідна наявність вірусу, сироватки, яка містить антитіла, і біологічного об’єкта, який виступає індикатором нейтралізації. Залежно від виду вірусу такими об’єктами можуть бути лабораторні тварини, курячі ембріони, тканинні культури.

Уреакції в якості антигена використовують культуральні рідини, алантоїсну

іамніотичну рідини курячих ембріонів, суспензії органів лабораторних тварин, в яких репродукувались віруси. Залежно від мети дослідження в якості антитіла

застосовують або сироватки хворого – для встановлення концентрації противірусних антитіл, або стандартні противірусні сироватки – для ідентифікації збудника. У першому випадку використовують сироватки, які були взяті у хворого на початку хвороби і в період реконвалесценції (метод парних сироваток).

Перед постановкою РН вірус попередньо титрують, визначаючи ту найменшу концентрацію, яка викликає цитопатичну дію або зараження експериментальних тварин чи курячих ембріонів. За титр вірусу приймають 50 % дозу (ЦПД50 – 50 % цитопатична доза).

ДлярозведеннявірусноїсуспензіїприпроведенніРНналабораторнихтвари- нахабокурячихембріонахвикористовуютьфосфатно-буфернийрозчин(рН7,0-7,2). Припостановціреакціїнакультуріклітинвживаютьтесередовище, вякомузвичайно перебувають дані клітини (розчин Ігла, середовище 199, гемогідролізат тощо).

Реакцію нейтралізації ставлятьтаким чином. До послідовних розведень досліджуваних сироваток вносять по 100 ЦПД50 вірусу і обидва реагенти інкубують при температурі 37 °С протягом 1-2 годин.

Після чого до суміші вірусу і сироватки додаютьсуспензію клітин або суміш вводять в організм лабораторних тварин чи курячі ембріони. Про наявність у сироватці хворого віруснейтралізуючих антитіл свідчить відсутність цитопатичної дії вірусу у культурі клітин або проявів інфікування лабораторних тварин (курячих ембріонів).

Досить часто для діагностики вірусних інфекцій вживається модифікація реакції нейтралізації – кольорова проба. В основі її лежить той факт, що в процесі життєдіяльності культури клітин у поживному середовищі накопичуються кислі продукти метаболізму, які зумовлюють зміну рН середовища і появу жовтого забарвлення.

Приінфікуваннікультуриклітиндеякимивірусами(ентеровіруси, реовіруси та ін.) пригнічується клітинний метаболізм і розвивається деструкція клітин – рН середовища не змінюється і колір середовища залишається рожевим. Нижче наводимо орієнтовну схему постановки такої реакції (табл. 21).

Реакція нейтралізації токсину антитоксином. При діагностиці деяких інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксини, використовують реакцію нейтралізації токсину антитоксином. Для її проведення досліджуваний матеріал, в якому передбачають наявність токсину, змішують з відповідною антитоксичною сироваткою і після інкубації в термостаті вводять лабораторним тваринам (білі миші, гвінейські свинки). Контрольним тваринам вводять тільки досліджуванийматеріал. Якщовзятадлядослідуантитоксичнасироватканейтра-

Таблиця 21

Схема постановки реакції нейтралізації (кольорова проба)

Термостат 37 °С – 6-8 д

Результат

лізує токсин, тварини залишаютьсяживими. Контрольнітварини, якимсироватку невводили, гинутьвіддіїекзотоксину. Реакціянейтралізаціївживаєтьсядлявиявлення токсинів збудників ботулізму, правця, газової анаеробної інфекції. При ботулізмі таку реакцію можна проводити в пробірках, використовуючи визначення фагоцитарного показника в присутності токсину і при додаванні до нього антитоксичної сироватки. Принаявностіудосліджуваному матеріалітоксину фагоцитарнийпоказникрізкознижується, принейтралізаціїтоксинуантитоксиномфагоцитарний показник буде в межах норми.

Частодлявизначенняактивностіімуннихантитоксичнихсироватокіанатоксинів вживається реакція нейтралізації за механізмом флокуляції (табл. 22).

Таблиця 22

Визначення активності імунної сироватки

У 6 пробірок вносять одержану протидифтерійну сироватку, активність якої потрібно визначити, в зменшуючих кількостях від 0,5 до 0,05 мл. До них додають відому кількість дифтерійного анатоксину по 180 І.О. і ставлять на водяну баню при 45 °С. Час від часу виймають пробірки і розглядають їх, відмічаючи ту, в якій наступила ініціальна флокуляція (помутніння чи пластівці). Визначають титр сироваткивантитоксичниходиницяхв1 мл. Приклад: ініціальнафлокуляціявідміченавпробірціз0,1 млсироватки, тобтов0,1 млсироваткиміститься180 АО і вони зв’язали 180 ІО анатоксину. Таким чином, в 1 мл сироватки міститься 180× 10= 1800 АО.

шенні 3:1 і швидко виливають у чашку Петрі або на скляні пластинки. Після його застигання з допомогою трафарету роблять лунки. У кожну дослідну лунку вносять по 0,5 мкл досліджуваної сироватки. У чотири контрольні лунки додають у чотирикратних розведеннях стандартну сироватку з відомим вмістом імуноглобулінів. Після чого чашки або пластинки поміщають у вологу камеру (ексикатор) на 24-48 год при 4 °С і оцінюють результати реакції. Вимірюють діаметри кілець преципітації навколо лунок. За величиною цих діаметрів кілець преципітації навкололунокізстандартноюсироваткоюбудуютькалібрувальнукриву. Прицьому враховують, що у певному інтервалі концентрації імуноглобулінів діаметр кільця прямо пропорційний логарифму концентрації імуноглобулінів (рис. 52).

Розчин сироватки анти Ig G

в 1 % гелі

Рис. 52. Реакція радіальної імунодифузії за Манчіні.

Феноменпреципітаціїшироковикористовуєтьсявмікробіологічнійпрактиці. Зокрема, всудово-медичнійекспертизійогозастосовуютьдлявизначеннявидової належності крові. За допомогою специфічних преципітуючих сироваток проти білка людини, різних тварин і птахів можна встановити, якому виду належить виявлена кров. Таким же чином визначають можливу фальсифікацію продуктів (м’ясо, мед). Цяреакціязастосовуєтьсядлядіагностикиепідемічногоцереброспінальногоменінгіту, чуми, дизентерії тощо. Особливе значеннямає реакція термопреципітаціїАсколі, якувикористовуютьдлявизначенняінфікованостізбудником сибірки продуктів і матеріалів тваринного походження (шкіра, хутро, щетина). Із досліджуваного матеріалу шляхом кип’ятіння екстрагують сибірковий антиген, який потім використовують для реакції.

Реакція Ухтерлоні за інформативністю переважає всі інші методи, в основі яких лежить феномен преципітації. Її використовують длявизначення антигенного складу органів і тканин, як нормальних, так і пухлинних, кількості антигенів у складних системах. Вона має важливе значення в діагностиці дифтерії, віспи та інших захворювань.

Зустрічнийімуноелектрофорез. Придіагностицірізноманітнихбактеріальних і вірусних інфекцій досить часто використовують метод зустрічного електрофорезу, результати якого можна одержати вже через 1-2 години після надходженняматеріалувлабораторію. Будучипорівнянопростимуметодичномувідношенні, він, як і всі імунодифузійні методи, відзначається дуже високою специфічністю.

Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – електрофорезу в гелі і наступної після нього подвійної імунодифузії.

Дляпроведенняреакціїімуноелектрофорезувикористовуютьскляніпластинки, предметні скельця, на які наносять тонкий шар агару або агарози. Спочатку антигени розміщують у центрі пластинки і розділяють їх в електричному полі. Потім у канавку, зроблену в агарі паралельно до лінії розділу антигенів, вносять специфічну сироватку. Дифундуючи назустрічодин одному, антигениіантитіла у місці контакту утворюють дуги преципітації (рис. 53).

Основні етапи проведення зустрічного лектрофорезу:

1.Наносять розтоплений гельтонким шаром 1,2-1,7 мм наповерхню скляної пластинки. Післязастиганняздопомогою спеціального шаблонавирізаютьвньому лунки.

2.У лунки вносять досліджуваний матеріал і стандартні реагенти (антигенмісткий матеріал – ближче до катода, імунну сироватку – ближче до анода).

Якщопроцедурупроводятьнаацетилцелюлознихмембранах, тонаносятьпо одній краплі реагентів на поверхню попередньо зволоженої мембрани.

3. Скляніпластинки розміщують в апараті і проводять електрофорез приоптимальнійнапрузі і визначеній силі струму протягом 30-60 хв.

4. Попередній облік результатів проводять за кількістю ліній преципітації, їхлокалізації, частковою чи повною ідентичністю у порівнянні із стандартними реагентами.

5. Промивають пластинки у відповідному розчині, фарбують, висушуютьіпроводятьзаключ-

Рис. 53. Схема проведення зустрічного імуноелектрофорезу. ний облік результатів.

Реакція лізису

Для реакції лізису необхідні антиген, антитіло й комплемент. Антигеном можуть бути мікроорганізми, еритроцити або інші клітини. Як антитіло (лізин) використовують специфічну сироватку або сироватку хворого. Залежно від того, протиякихклітинспрямованадіялізинів, вонимаютьсвоїназви: протибактерій – бактеріолізини, спірохет– спірохетолізини, еритроцитів– гемолізини, протиінших клітин – цитолізини. Комплемент при утворенні комплексу клітина (антиген) – антитіло, зв’язується з ним, активується за класичним шляхом і викликає розчи-