Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

.pdf
Скачиваний:
1851
Добавлен:
22.09.2018
Размер:
6.11 Mб
Скачать

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

121

гічний попередньому. Для цього готуютьсерію розведень антибіотика в агарі, додаючи один об’єм, який містить певну кількість препарату до 9 об’ємів агару. Для цього зручно розлити агар у флакони або широкі пробірки по 13,5 мл. Перед постановкою агар розплавляють на водяній бані і після охолодження до 60-65 °С у кожну пробірку додають 1,5 мл відповідного розведення антибіотика (в бульйоні), ретельно перемішують і виливають у чашку Петрі. У контрольну пробірку з агаром замість розчину антибіотика вносять 1,5 мл дистильованої води. Чашку поділяють на сектори, на кожний з яких засівають досліджуваний штам. Посіви роблятьбактеріологічноюпетлеюабопастерівськоюпіпеткою. Дляпосівузручно використати спеціальний штамп-реплікатор, який дозволяє нанести одночасно на поверхнюагару25-50 досліджуваних культур. Результативраховуютьпісля18-24 год інкубації в термостаті при оптимальній температурі. За МПК антибіотика для даного штаму приймають ту, при якій відсутні ознаки росту колоній на поверхні агару (або замість бляшки є ріст поодиноких колоній).

З двох способів визначення антибіотикочутливості мікробів до антибіотиків (розведень у густому та рідкому середовищах) більш точним є метод серійних розведень у рідкому середовищі. Результати, які одержують за допомогою розведень в агарі, менш постійні. Метод не слід застосовувати при оцінці чутливості тих мікробів, які дають тонкий, розріджений ріст на поверхні чашки (стрептококи, пневмококи) або, навпаки, мають тенденцію до повзучого росту (протей).

Недоліком методівсерійних розведень є їх високатрудоємність, що обмежує використаннявзвичайнихбактеріологічнихлабораторіях. Зметоюспрощеннябуло запропоновано модифікацію методу із заміною ряду з 10 пробірок, що містять різнікількостіпрепарату, трьомаконцентраціямиантибіотика. Першазнихвідповідає максимальній, щознаходиться у крові при введенні терапевтичних доз, друга – рівню, що спостерігається через Т1/2 (час зниження концентрації антибіотика на50 %). Третяємінімальною, тобтотою, якадорівнюєМПКдлявисокочутливих штамів. У відповідності до використаних концентрацій антибіотиків досліджувані штами можна віднести за рівнем чутливості до трьох основних груп: резистентні(МПКдляякихперевищуєзначеннямаксимальноїконцентраціїантибіотика у крові), помірно чутливі (значення МПК наближаються до максимальної або середньої концентрації) і високочутливі (чутливість яких до антибіотика знаходитьсянарівнімінімальноїконцентрації, щовикористовуєтьсяудосліді). Такими концентраціямипривизначеннічутливостідобензилпеніцилінуєвідповідно0,05- 0,2, 0,5 і 2,0 ОД/мл, до макролідів – 0,1, 0,5-1,0 і 4,0 мкг/мл, до аміноглікозидів –

0,5-1,0, 6,0-8,0 і 15,0-20,0 мкг/мл.

Прискорені методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіо-

тиків. Використовуючизвичайніметоди, відповідьможебутиотриманачерез1820 год від початку дослідження, не враховуючи етапів виділення чистої культури. Це призводить до того, що у більшості випадків особливо при затяжному та тяжкому перебігу хвороби, лікування антибіотиками починають задовго до одержання даних лабораторного обстеження. Залежно від принципів, на яких вони базуються, прискорені методи передбачають:

122

Частина І. Загальна мікробіологія

визначення змін ферментативної активності мікроорганізмів під впливом антибіотиків;

визначеннякольору редокс-індикаторівпризмініокисно-відновногопотен- ціалу під час росту бактерій у живильному середовищі;

цитологічну оцінку змін морфології бактеріальних клітин під впливом антибіотиків.

До першої групи належить метод Роджерса, орієнтований на здатність анти-

біотиків пригнічувати ферментативну активність чутливих мікроорганізмів, що супроводжується зміною кольору відповідного індикатора. Суть його полягає у диференційованій зміні червоного кольору фенолового червоного на жовтий або фіолетовий залежно від чутливості досліджуваного штаму. У випадку чутливості додіїантибіотиканевідбуваєтьсярозкладанняглюкозиприкультивуванніусередовищі, яке містить її та певні концентрації препарату. При цьому середовище забарвлюєтьсяуфіолетовийколірвнаслідокзсувурНулужнусторону. Зміначервоного кольору на жовтий свідчить про розщеплення глюкози з утворенням кислотивнаслідокростуштаму, резистентногододіїантибіотика. Якщодосередовища додати 0,25 % дріжджового екстракту, результати можуть бути врахованими вже через 2-2,5 год від початку дослідження.

Наступна група методів реєструє зміни окисно-відновного потенціалу середовищавпроцесі ростумікроорганізмів, прощосвідчитьзмінакольору резазурину, 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу та інших, які додаються до середовища. Цей метод технічно простий, а результати одержують через 2-6 год. Принцип його зводиться до того, що розтоплений та охолоджений до50 °Сагарзасіваютьдосліджуваноюкультуроюбактерійізрозрахунку200 млн. мікробних тіл, а на поверхню накладають диски з антибіотиками. Чашки інкубують при оптимальній температурі протягом 3-5 год, потім обробляють індикатором і повторно інкубують при 37 °С протягом 20-30 хв. Результати враховують за зміною кольору навколо дисків з антибіотиками. Якщо використовують 1 % розчин 1,3,5-трифенилтетразолію хлориду, ділянки агару з бактеріальним ростом внаслідок утворення формазану набувають червоного кольору, а зони пригнічення росту навколо дисків залишаються безбарвними.

Судити про ступінь чутливості мікробів до антибіотиків можна з такою ж точністю, як і за допомогою стандартного методу дисків, проте час дослідження зменшується до 3-5 год.

Утворення інволюційнихформбактерій під впливомантибіотиків досліджу- ютьпідфазово-контрастнимчиантоптральниммікроскопомуспеціальнихмікро- капсулах. Вони утворюються внаслідок дії бактеріостатичних концентрацій препарату. Під впливом суббактеріостатичних концентрацій, а також при резистентностідосліджуваногоштамунаповерхніагарувиростаютьнормальнімікроколонії.

Метод може бути застосований для визначення чутливості штамів кишкової палички, стафілококів, холерних вібріонів. Отримані дані у більшості випадків збігаються з тими, які дають класичні методи.

Розділ 8. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків

123

Заостаннірокирозробленочисленнімодифікаціїметоду серійнихрозведень у живильних бульйонах. Зокрема, експрес-методи з титруванням антибіотика в об’ємі 0,25 мл.

Випускаються комерційні набори тривалого зберігання, які складаються з планшетівзліофільновисушенимирозведеннямиантибіотика, кудивноситьсяпо 0,1 мл суспензії чистої культури мікроорганізмів. Результати визначення антибіотикочутливості можна оцінювати візуально (при наявності у середовищі індикатора) або за допомогою спектрофотометрів, коли реєструється зміна оптичної густини середовища.

Визначатичутливістьбактерійдоантибіотиківможнайзадопомогоюавтома-

тизованих мікробіологічних систем (“Autobac MS-2”, “Cobas Micro”, Quantum 2, Sceptor таін.). Приїхвикористаннірезультатиотримуютьвжечерез3-10 год. Одна зїхперевагполягаєвтому, щовонидозволяютьотримуватирезультатиодночасно до 18-20 антибіотиків. Ці методи широко використовують у мікробіологічних лабораторіях, вонидобрекорелюютьзіншимиметодиками ізаїхдопомогоюможна не тільки вибирати раціональну схему антибіотикотерапії, але й проводити епідеміологічний контроль резистентності.

Однак при користуванні такими автоматизованими системами частота виявленнярезистентнихштамівможебутизниженавнаслідокповільногоростустійких варіантів. У більшості подібних систем результати враховують шляхом порівнянняросту(абозагибелі) бактеріальнихклітинуприсутностіантибіотиківзконтролем, де є тільки мікроби. За цих умов досить важко диференціювати клітини, які гинуть, від тих, що повільно розмножуються.

До інших факторів, які впливають на результати, належить дія субінгібіторнихконцентраційпрепаратівнаультраструктурубактеріальнихклітин. Вонипризводять до зміни форми, набухання клітин, що може супроводжуватись зміною оптичної густини суспензії та спотворенням результатів. В свою чергу, це дає неправильну інформацію про чутливість збудників.

Таким чином, застосування будь-якого методу дозволяє визначити антибіотикограму збудника – спектр його чутливості та антибіотикостійкості.

Усіметодивизначеннячутливостібактерійдоантибіотиківмаютьсвоїпереваги і свої недоліки. Тому постійний контроль за об’єктивністю результатів і дотриманням правил проведення досліджень сприяють одержанню достовірних даних.

У більшості випадків результати визначення антибіотикостійкості in vitro збігаються з клінічними наслідками антибіотикотерапії. Випадки розбіжності пояснюються рядом причин, серед яких найчастіше зустрічається помилкове трактування одержаних лабораторних даних.

Причиноютакихситуаційможебутивикористанняприпосівінечистоїкультури бактерій, а патологічного матеріалу. Тому визначається не чутливість інфекційного агента, а мікробної асоціації, в тому числі й сапрофітної флори. Помилки зустрічаються при дослідженні вмісту дванадцятипалої кишки, фекалій, харкотиння, виділень з ран, сечі тощо.

124

Частина І. Загальна мікробіологія

Плазміди роблять бактерії нечутливими до переважної більшості антибіотиків, які використовуються у клініках, оскільки кодують синтез ферментів, що руйнуютьпрепарати. Однимзнайдослідженішихферментів єбета-лактамаза, яка руйнує антибіотики, що належать до групи бета-лактамів. Розроблено декілька методичнихприйомів, щодозволяютьшвидковизначитиїїактивність. Одинзних полягає в тому, що на фільтрувальний папір розміром 2× 2 см, що знаходиться в чашці Петрі, капають одну краплю 2 % водного розчину крохмалю. Потім на цей папірнаносятьпетлеюагаровукультурумікробівірозтираютьїї, формуючибляшку діаметром до 5 мм. На її поверхню наносять робочий йодний розчин пеніциліну.

Облік результатів проводять через 10 хв інкубації системи при кімнатній температурі. Принаявностібета-лактамазинатемно-синьомуфоніспостерігаєть- ся яскраво виражена чітказона просвітління навколо бляшки, що містить агарову культуру мікробів. При негативному результаті зона просвітління відсутня, а краї бляшки нечіткі.

Визначення концентрації антибіотиків у біологічних рідинах. При тяж-

ких інфекційних процесах, наприклад, сепсисі інколи доводиться визначати концентраціюантибіотиківубіологічнихрідинах, зокрема, сироватцікрові, сечі. Для цьоговикористовуютьметодсерійнихрозведень(табл. 16) нарідкомусередовищі з глюкозою та індикатором Андреде. У двох паралельних рядах готують серійні розведення сироватки і стандарту антибіотика. Потім до кожної пробірки, включаючи контрольні, додають стандартну суспензію тест-мікробів. Пробірки інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18 год. У тих пробірках, де концентрація антибіотика пригнічує мікроби, середовище залишається безбарвним і прозорим. Якщо мікроорганізми проростають, про це свідчить помутніння середовища і поява рожевого забарвлення.

Можнавикористатитакожфенол-сироватковесередовищезіндикаторомфено- ловим червоним. У цьому випадку при відсутностіросту мікроорганізмів середовище залишається червоним, а при наявності ознак росту стає мутним і набуває жовтого кольору.

Виходячиізданихтаблиці, розчинстандартупеніцилінузатримуєрісттест-мікро- бівуконцентрації0,025 ОД/мл, адосліджуванасироватка– врозведенні1:8. Отже, вміст пеніциліну в сироватці крові буде дорівнювати 0,2 ОД/мл (0,025 ОД/мл× 8).

Визначення концентрації пеніциліну в сироватці крові

Таблиця 16

 

 

 

 

 

 

 

 

Пробірки

1

2

3

4

5

6

Розведення сироватки

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

Ріст тест-мікробів

-

-

-

+

+

+

Концентрація стандарту

0,2

0,1

0,05

0,025

0,0125

0,0063

пеніциліну в середовищі,

 

 

 

 

 

 

ОД/мл

 

 

 

 

 

 

Ріст тест-мікробів

-

-

-

-

+

+

 

 

 

 

 

 

 

Примітка: “+” – ріст тест-мікробів, “-” – відсутність росту

Частина ІІ

ІМУНОЛОГІЯ

Розділ 9

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХЗАХВОРЮВАНЬ

У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють імунологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імунокомпетентними клітинами (лімфоцитами).

Основою імунологічних механізмів є те, що антитіла і лімфоцити, які утворились при попаданні в організм антигену, реагують тільки з ним, а не з іншими антигенами. Головною функцією антитіл є зв’язування антигену і його подальше видалення з організму.

Проте такі реакції між антигенами і антитілами можуть відбуватись і поза організмом (in vitro) у присутності електроліту. Виходячи з їх специфічності, реакції можливі лише тоді, коли антитіло та антиген комплементарні один одному. Маючи специфічні антитіла проти певного антигена, можна розпізнати і визначити його серед інших. І, навпаки, можна виявити в сироватці крові антитіла проти конкретногоантигена. Нацьомупринципібазуютьсявсіімунологічнідіагностичні реакції, якіназвалисерологічними, томущоантитілазнаходятьсявсироватцікрові людей і тварин (serum – сироватка).

Реакція антиген-антитіло in vitro супроводжується виникненням декількох феноменів – аглютинації, преципітації, лізису. Зовнішній прояв реакції залежить від фізико-хімічних властивостей антигена, класу антитіл і умов середовища.

Аглютинаціяіпреципітаціяхарактеризуютьсяутвореннямвидимихагрегатів внаслідок об’єднання багатьох комплексів антиген-антитіло. Лізис зумовлений зв’язуванням комплементу комплексом антиген-антитіло з наступним руйнуванням клітини.

Антитіла, що беруть участь у реакції, відповідно до кожного феномена називають аглютинінами, преципітинами, лізинами.

Таким чином, всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою: 1) длявиявленняантитілусироватціхворогоздопомогоюстандартнихантигенівдіагностикумів – для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами – для серологічної ідентифікації збудників. При цьому невідомий компонент визначають за відомим. Наприклад, якщо сироватка

126

Частина ІІ. Імунологія

хворого реагує з конкретним мікробним антигеном, це означає, що в сироватці є антитілапротиданогомікроорганізму. Авидзбудника, виділеногоізпатологічного матеріалу, визначають за допомогою відомої імунної сироватки (антитіла).

Відповідно до цього, в серологічних реакціях завжди використовують один компонент стандартний, інший, який виявляють, одержуютьвідхворого. Так, для серологічної діагностики беруть стандартні антигени – діагностикуми: суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Для серологічної ідентифікації застосовують стандартні імунні сироватки. Їх одержують шляхом гіперімунізації тварин відповідними бактерійними чи вірусними антигенами, в результаті якої в крові проти них з’являється значна кількість антитіл. Одержавши сироватку крові імунізованої тварини і очистивши від баластних речовин, її використовують як імунну сироватку. При одержанні такої сироватки визначають її титр – найбільше розведення, в якому ще проявляєтьсяреакціязвідповіднимантигеном. Набориізрізноманітнихдіагностикумів та імунних діагностичних сироваток є в кожній бактеріологічній лабораторії.

Усіімунологічніметоди, щовживаютьсядлядіагностикиінфекційнихзахворювань можна поділити на три групи:

1.Тести, в яких відбувається безпосередня взаємодія антигена з антитілом. До цієї групи належать: імунофлуоресценція, радіоімунні та імуноензимні тести.

2.Тести, в яких відбуваються різні фізико-хімічні реакції або беруть участь додаткові елементи (носії, комплемент). До них належать: імунодифузія, імуноелектрофорез, пряма аглютинація (бактерійна), непряма аглютинація з використаннямеритроцитів(пасивнагемаглютинація), латексу(латекснааглютинація) або

інших часточок, таких як бентоніт, холестерол, деревне вугілля, коаглютинація (використання білка А Staphylococcus aureus) і реакція зв’язування комплементу.

3. Тести, щобазуються на використанні певних біологічних ефектів, наприклад, опсонізація, фагоцитоз, хемотаксис. До них належать: опсонофагоцитарна проба, хемотаксис, імуноадгезія, клітинна дегрануляція.

Реакція аглютинації (РА)

Аглютинація– цесерологічнареакціяміжантитілами(аглютинінами) іантигенами (аглютиногенами), розміщеними на поверхні бактеріальної клітини. Ця реакція призводить до утворення специфічного комплексу антиген – антитіло (аглютинат).

Клітинизприєднанимидонихаглютинінамиз’єднуютьсявагрегати, внаслідок чогорівномірна суспензія клітин, спочатку мутна, склеюється в пластівці, які зависають у прозорій рідині або осідають на дно. В аглютинації беруть участь виключно поверхневі антигени, які доступні антитілам. Антигени, розміщені у внутрішніх структурах клітини, не беруть участі в цій реакції. Механізм аглютинації полягає в тому, що під впливом іонів електроліту зменшується негативний поверхневийзарядбактерійнихклітин, івониможутьзблизитисьнатакувідстань, при якій виникає склеювання бактерій (рис. 42).

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

127

Реакціюпроводятьнасклі, пластмасових пластинках, у пробірках, лунках полістиролових планшет.

Аглютинацію на склі або пластинках найчастіше використовують для ідентифікації бактерій з допомогою відомих сироваток; аглютинація в пробірках і планшетах – з метою виявлення титру аглютинінів у сироватці хворого з допомогою відомих діагностикумів.

Найбільше розведення сироватки, при якомущеспостерігаєтьсяаглютинаціябак-

терій, приймається за її титр, який характе- Рис. 42. Реакція аглютинації. ризує рівень специфічних аглютинінів.

Макроскопічний і мікроскопічний вигляд аглютинації бактерій залежить від виду поверхневих антигенів, які беруть участь у реакції. Аглютиніни, які реагують з О-соматичним антигеном, дають дрібнозернисту аглютинацію. Соматична аглютинаціявпробіркахзавершуєтьсячерез24 години, прицьомувиникаютькомпактнізерна, крупинки, які важкорозбитиприструшуванні. Примікроскопії видно, що бактерії склеюються полюсами, утворюючи сітку.

В аглютинації з поверхневими Vi-антигенами спостерігається склеювання бактерій між собою всією поверхнею, що дає рівномірний осад. У певній мірі макроскопічно Vi-аглютинація нагадує соматичну.

Сироватки, якімістятьантитілапротиджгутиківбактерій, аглютинуютьзначношвидше. Вжечерез30-40 хвокреміконгломератибактерійувиглядіпластівців вільно осідають на дно пробірки. Аглютиніни анти-Н безпосередньо взаємодіють зджгутиками, знерухомлюючибактерії. Мікроскопічноможнаспостерігатисклеювання бактерійних клітин з допомогою джгутиків. Це крупнопластівцева, або Н-аглютинація (рис. 43).

ПостановкаРА. Існуєдвірізновидностіпостановкиреакції: орієнтовнааглютинація на склі й розгорнута аглютинація в пробірках.

Реакціяаглютинаціїнасклі. Напредметнесклонаносятьроздільно2 краплі специфічної сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. В краплю

а

б

в

Рис. 43. Аглютинація бактерій: а – О-аглютинація (соматична), дрібнозерниста; б – Vi-аглютинація; в – Н-аглютинація (джгутикова), крупнопластівцева.

128

Частина ІІ. Імунологія

ізотонічного розчину й одну з крапель сироватки бактеріологічною петлею вносять досліджувану культуру й ретельно її емульгують. Після внесення культури в одну із крапель необхідно простерилізувати петлю, знову набрати культуру і внести її у другу краплю. Крапля сироватки, куди не вносили культури, є контролем сироватки.

Реакція проходить досить швидко при кімнатній температурі. Якщо контрольна крапля сироватки залишається прозорою, в краплі ізотонічного розчину – рівномірнепомутніння, авкраплі, декультуразмішаназсироваткою, з’являються зернистість або пластівці, реакція вважається позитивною.

Проте орієнтовна реакція аглютинації дозволяє зробити лише попередній висновокпровиділенукультуру, томущобагатобактеріймаютьспільніантигени.

Щоб остаточно підтвердити або відкинути попередній висновок ставлять розгорнуту реакцію аглютинації (табл. 17). Діагностичні аглютинуючі сироватки, якіодержанішляхомгіперімунізаціїтварин, маютьвисокийтитр(1:20000-1:40000 і вище).

Таблиця 17

Постановка реакції аглютинації для ідентифікації E. coli

Компоненти, мл

 

 

Пробірки

 

 

Контроль

1

2

3

4

5

6

сиро-

анти-

 

ватки

гена

 

 

 

 

 

 

 

0,85 % розчинхлориду

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

-

1,0

натрію

 

 

 

 

 

 

 

 

ОК-колі сироватка

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

-

в розведенні 1:50

 

 

 

 

 

 

 

 

Розведення

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:100

-

сироватки

 

 

 

 

 

 

 

 

Cуспензія E.coli

2

2

2

2

2

2

-

2

(краплі)

 

 

 

 

 

 

 

 

Термостат 37 °С – 2 год.

Результат

Спочатку готують робоче розведення сироватки (1:50 або 1:100), із якого надалі одержують двократні розведення від 1:100 до титру, вказаного на ампулі з сироваткою. Для цього в ряд пробірок розливають по 1 мл ізотонічного розчину, потім у першу пробірку вносять такий же об’єм сироватки робочого розведення і післяперемішування1 млпереносятьудругу, звідтивтретюіт.д., авпередостанню пробірку додають 1 мл сироватки робочого розведення. В останню пробірку сироватку не вносять. Потім у всі пробірки додають по дві краплі досліджуваної культури.

Контрольніпробірки– двіостанні. Передостання– контрольсироватки, остання – контроль антигену. Після струшування штатив із пробірками поміщають у термостат при 37 °С на дві години і згодом залишають при кімнатній температурі до наступного дня. Після чого проводять облік результатів. Якщо реакція виявилась позитивною до титру або до половини титру, вона вважається достовірною.

Розділ 9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань

129

Розгорнутуреакціюаглютинаціїставлятьіприсерологічнійдіагностицізахворювання. Тільки в цьому випадку роблять ряд послідовних розведень сироватки хворого (1:100-1:1600) і до кожного розведення додають по дві – три краплі діагностикуму.

При деяких інфекційних захворюваннях реакції аглютинації, що вживаються з діагностичною метою, мають свої назви: при черевному тифі – реакція Відаля, висипному тифі – реакція Вейгля, при бруцельозі – реакція Райта (табл. 18).

Таблиця 18

Схема постановки реакції аглютинації Райта

Компоненти, мл

 

 

Пробірки

 

 

Контроль

1

2

3

4

5

6

сиро-

анти-

 

ватки

гена

 

 

 

 

 

 

 

Розчин хлоридунатрію

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

-

1,0

Сироватка хворого

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0

1,0

-

в розведенні 1:50

 

 

 

 

 

 

 

 

Розведення сироватки

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:100

-

Бруцельозний

3

3

3

3

3

3

3

3

діагностикум(краплі)

 

 

 

 

 

 

 

 

Термостат 37 °С 18-20 год

Результат

Реакція непрямої аглютинації (РНГА). За своєю чутливістю значно пере-

вищує пряму реакцію аглютинації і дозволяє виявити мінімальну кількість антитіл і антигенів. Така висока чутливість досягається завдяки адсорбції антигенів або антитіл на спеціальних інертних частинках (латекс, бентоніт) або клітинах (еритроцити). Якщоантигениадсорбованінаеритроцитах, такареакціяназивається реакцією непрямої (пасивної) гемаглютинації (рис. 44).

Навантажені антигеном еритроцити склеюються в присутності специфічних антитіл і випадають у вигляді пухкого осаду з нерівним фестончастим краєм (перевернутої “парасольки”) на дні пробірок або лунок.

АнтигенидляРНГАназиваютьсяеритроцитарнимидіагностикумами. Цестандартні препарати, які складаються з антигенів різних бактерій і вірусів, адсорбованих на поверхні еритроцитів. За допомогою еритроцитарних діагностикумів можна виявляти в сироватці хворих антитіла до будь-якого збудника.

Рис. 44. Схема реакції непрямої гемаглютинації.

130

Частина ІІ. Імунологія

РНГА можна використовувати й для серологічної ідентифікації збудника. У цьому випадку як індикатор використовують еритроцити, навантажені відповіднимиантитілами. Придодаваннідонихкультуризбудникавиникаєфеноменгемаглютинації. На відміну від попередньої реакції, її називають реакцією оберненої (зворотної) непрямої гемаглютинації (РОНГА).

Недоліком непрямої (пасивної) гемаглютинації є те, що антитіла, які знаходяться на поверхні еритроцитів, можуть не викликати їх склеювання. Частковоце можна пояснити тим, що поверхня еритроцитів має негативний електричний заряд, який заставляє їх триматися на відстані близько 25 нм один від одного. Вони можутьаглютинуватисьуприсутностіспецифічногоантигенулишетоді, колинегативний заряд зменшиться настільки, щоб еритроцити могли зблизитись. Цього можнадосягти, додаючидосередовищаальбумін(5-30 %), декстранабополівініловий піримідон. Ці сполуки мають позитивний заряд, який нейтралізує негативні заряди еритроцитів. Зняти негативний заряд можна також, діючи на еритроцити такими ферментами як трипсин, папаїн та ін. Завдяки цьому, еритроцити зближуються між собою і можуть утворювати зв’язки між антигенами та антитілами.

Реакція непрямої гемаглютинації широко використовується у діагностиці вірусних, бактеріальних, грибковихіпаразитарнихінфекцій. Длянавантаженняеритроцитів найчастіше використовують полісахаридні антигени бактерій або грибів, які легко адсорбуються на поверхні свіжих еритроцитів барана і людини групи О Rh(-). Поверхнюеритроцитівможназмодифікувати, використовуючихімічнісполуки (танін, двоазобензидин) і тоді на них можна адсорбувати і білкові антигени.

РНГА відноситься до найбільш чутливих реакцій у порівнянні з аглютинацією, преципітацією і зв’язуванням комплементу. З допомогою цієї реакції антитіла в сироватці хворого при деяких захворюваннях виявляють вже з третьої доби від моменту зараження.

Методика постановки РНГА. У ряд лунок полістиролової планшети наливають по 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, потім у першу лунку вносять 0,5 мл сироватки хворого (1:50) і одержують розведення сироватки 1:100. З першої лунки переносять 0,5 мл у другу, одержують розведення 1:200, з другої в третю і т.д., крім останньої. З передостанньої лунки 0,5 мл виливають, потім в усі лункидодаютьпо0,25 млвідповідногоеритроцитарногодіагностикуму(табл. 19). Планшети поміщають у термостат при 37 °С на 2-3 год.

Результатреакціїоцінюютьзавиглядомосадуеритроцитів, починаючизконтролю, де вони повинні осісти на дно у вигляді круглого компактного осаду з рівними краями. У лунках із сироваткою при позитивній реакції осад буде мати нерівні краї і покриватиме майже всю лунку.

Інтенсивність РНГА оцінюють за чотириплюсовою системою: якщо майже всі еритроцити аглютинувались і утворився осад, який нагадує перевернуту “парасольку”, – реакція позитивна (++++, +++); не всі еритроцити аглютинувались, мереживоподібнийосадменшогорозміру(++); більшістьеритроцитівнесклеїлись і утворюють у центрі дна лунки компактний диск з нерівними краями – реакція слабопозитивна (+) (рис. 45).