Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

ненняклітини. Безкомплементулізисклітининеможливий. Розрізняютьдекілька реакцій лізису: бактеріолізу, гемолізу, цитолізу. Реакцію бактеріолізу з діагностичною метою практично не використовують. Частіше ставлять реакції гемолізу й цитолізу.

Постановка реакції гемолізу. Компонентами є антиген (еритроцити барана), антитіло (гемолітична сироватка), комплемент (свіжа сироватка гвінейської свинкиабостандартнийсухийкомплемент). Дляодержанняеритроцитівубарана берутькровізяремної вени у стерильний флакон із скляними кульками й енергійно струшують, щоб нитки фібрину намотались на кульках, і кров не згорнулась. Потім ізотонічним розчином хлориду натрію відмивають еритроцити від плазми. Дляцьогокровцентрифугують10 хвпри2000 об/хв. Плазмувідсмоктуютьпіпеткою, а до осаду еритроцитів знову додають ізотонічний розчин, ретельно перемішують і центрифугують. Таке промивання еритроцитів роблять тричі. Рідину обережно відсмоктують, а з осаду еритроцитів готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині.

Гемолітичну сироватку (гемолізин) одержують шляхом імунізації кроликів еритроцитами барана. Після циклу імунізації у них беруть кров, з якої готують сироватку, демістятьсяантитілапротиеритроцитів. Дляінактиваціїкомплементу, що знаходиться в ній, її прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і визначають титр.

Для постановки реакції гемолітичну сироватку беруть у потрійному титрі. Наприклад, якщо титр сироватки 1:1800, то її розводять до 1:600. Комплемент беруть у розведенні 1:10 (табл. 23).

Реакція вважається позитивною, якщо всі еритроцити лізувались. Рідина червоного кольору й абсолютно прозора. Ніякого осаду на дні пробірки немає. Реакція негативна, якщо еритроцити компактно осіли на дно, рідина над ними безбарвна.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

ХарактерноювідмінністюРЗКвідреакціїаглютинаціїйпреципітаціїєучасть в ній, крім антигена й антитіла, інгредієнтів реакції гемолізу, яка виступає у вигляді індикаторної системи. Взаємодія антигена з антитілом не завжди зумовлює візуальні зміни, які дозволяють визначити результат реакції. Проте відомо, що

при утворенні комплексу антиген – антитіло до нього завжди приєднується комплемент. Якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент не зв’язується, залишаєтьсявільнимусистемі. Придодаваннікомплексуеритроцити барана – гемолізини вільний комплемент, зв’язуючись з ним, викликає гемоліз еритроцитів. Цей принцип і покладено воснову РЗК. При відповідності антигена антитілузнимзв’язуєтьсякомплемент. Щобпереконатисьвцьому, додаютьеритроцити барана й гемолітичну сироватку. При відсутності гемолізу роблять висновок, що реакція позитивна, при наявності гемолізу – реакція негативна (рис. 54).

Рис. 54. Схема реакції зв’язування комплемента.

Для сероідентифікації використовують стандартні діагностичні сироватки відомого титру. Для серологічної діагностики досліджувану сироватку прогрівають при 56 °Спротягом30 хв, дляінактиваціївласногокомплементу, апотімготують ряд послідовних розведень для визначення титру антитіл. Антигенами можутьбутибактеріальні клітини, віруси, білкові абополісахаридні речовини, екстракти органів і тканин.

Комплемент представлено свіжою або ліофілізованою сироваткою гвінейськоїсвинки, якурозводять1:10. Гемолітичнусироваткувикористовуютьупотрійному титрі, а з еритроцитів барана готують 3 % суспензію в ізотонічному розчині хлориду натрію.

Підготовка реагентів. Промисловість випускає стандартні гемолітичні сироватки з відомим титром, який вказаний на етикетці. Але при довготривалому зберіганні з метою перевірки його гемолітичні сироватки перед основним дослідом титрують (табл. 24). У ряді пробірок в об’ємі 0,5 мл готують послідовні розведення гемолізину дотитру. Укожнупробіркувносятьпо0,5 мл3 % зависіеритроцитів, по0,5 млкомплементу урозведенні1:10 іпо0,5 млфізіологічногорозчину. Пробіркиставлятьутермостатпри37 °Сна1 годину. Привідсутностігемолізу вконтроліоцінюютьйогоступіньудосліднихпробіркахзатрьохплюсовоюсистемою: повний гемоліз (+++), частковий гемоліз (++ або +), відсутність гемолізу (–).

За титр гемолітичної сироватки приймають те найбільше її розведення, яке в присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів. В РЗК беруть робочу дозу гемолітичної сироватки у потрійному титрі. Якщо титр сироватки складав 1:1800, то робочою дозою буде 1:600.

Термостат 37 °С – 60 хв

Результат

Титрування комплементу проводять в день постановки РЗК для визначення дози, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб повністю зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу залишиться незв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, останні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний результат РЗК. Ось чому так важливо визначати титр комплементу.

Перед початком титрування в ампулу з сухим комплементом додають 1 мл ізотонічного розчину. Одержанийрозчин додатково розводять1:10 івикористовують як вихідний для визначення титру комплементу.

Для цього в ряд пробірок вносять зростаючі на 0,05 мл дози комплементу, починаючи від 0,05 мл до 0,5 мл, і в кожну пробірку до кінцевого об’єму 1,5 мл додають ізотонічний розчин хлориду натрію.

Попередньо готують гемолітичну систему, яка складається з рівних об’ємів 3 % суспензії еритроцитів барана і гемолітичної сироватки в робочому титрі. Її витримують при температурі 37 °С протягом 30 хв, що необхідно для зв’язування еритроцитів із гемолізином (табл. 25).

Після приготування відповідних розведень комплементу в усі пробірки вносять по 1,0 мл гемолітичної системи і до об’єму 2,0 – 0,5 мл ізотонічного розчину. Суміш змішують і ставлять в термостат при 37 °С на 1 годину.

Результати реакції оцінюють за появою гемолізу. Титром комплементу буде тайого найменша кількість, при якій спостерігається повний гемоліз (+++). Робоча доза комплементу завжди буде більшою від титру на 25 %, і практично вона буде міститись у наступній пробірці. Наприклад, якщо в першій пробірці, де є повний гемоліз, знаходилось 0,2 мл комплементу, за робочу дозу приймають 0,25, ту кількість, що знаходиться в наступній пробірці.

Постановка основного досліду РЗК. Класичну методику постановки РЗК запропонували Ж. Борде і О. Жангу для діагностики хронічної гонореї. Згідно з цією методикою кожен компонент реакції беруть в кількості 0,5 мл, і загальний об’єм її становить 2,5 мл.

Припостановці РЗКкомпоненти вносять у певній послідовності. Спочаткув пробірки, у яких міститься розведена сироватка хворого, додають рівні об’єми антигенаікомплементувробочійдозі. Пробіркиретельнострушуютьіставлять у термостат при 37 °С на 1 год. За цей час з’єднується антиген з антитілом, і на цьомукомплексіфіксуєтьсякомплемент. Одночасновтермостатіінкубуютьгемолітичну систему. Через годину в усі пробірки основного досліду додають по 1 мл гемолітичноїсистемиізновуставлятьутермостат. Через30-45 хвпроводятьоблік реакції при умові повного гемолізу в контролях сироватки, антигена і комплементу (табл. 26).

Таблиця 26

Схема постановки основного досліду РЗК

РЗКоцінюютьзачотириплюсовоюсистемою: різкопозитивнареакція(++++,

+++) – повна затримка гемолізу, рідина безколірна або блідо-рожевого кольору, еритроцити осідають на дно; позитивна реакція (++) – часткова затримка гемолізу, рідина рожевогокольору, компактний осадеритроцитів; сумнівна реакція (+) – незначна затримка гемолізу, на дні ледь помітний осад, рідина рожевого кольору; негативна реакція (–) – повний гемоліз, осад відсутній, рідина червона і прозора.

Реакція зв’язування комплементу відзначається більш високою специфічністю ніж реакція аглютинації, проте вона менш чутлива. Антитіла, які зв’язують комплемент, виявляються на 2-4 тижні від моменту захворювання, в той же час аглютиніни можна знайти вже через 1-2 тижні.

РЗК набула широкого розповсюдження для діагностики багатьох інфекційнихзахворювань, алергічнихстанів. Вонавикористовуєтьсядлясерологічноїдіагностики захворювань бактерійної етіології (сифілісу, лептоспірозу, бруцельозу, туляремії, лістеріозу, озени, орнітозу та ін.), вірусного походження (грипу, паротиту, цитомегалії, поліомієліту, лімфоцитарногоменінгіту, енцефалітутощо), грибкових (кандидозу, асперігельозу), а також токсоплазмозу, пневмоцистозу тощо.

Реакція імунофлуоресценції (РІФ)

Позитивнірезультатиреакційаглютинації, преципітації, лізису, РЗКйінших спостерігаютьтількиприоптимальномуспіввідношенніреагентів. Якщоцяумова не виконується, зафіксувати видимий позитивний результат не завжди вдається.

Чутливістьімунологічнихреакційзначнозростаєзавдякивикористаннюмічених реагентів, наприклад, антитіл, кон’югованих з флуохромом. При зв’язуванні таких імуноглобулінів з антигеном в люмінесцентному мікроскопі спостерігають світінняоб’єктів(бактерій, вірусів, клітин), покритихміченимиантитілами. Імунофлуоресцентним методом можна також визначати антитіла в сироватці хворого, на поверхніклітинітканин. Уцьому випадку використовуютьміченіфлуоресцеїномсироваткипротиглобулінівлюдини(антиглобулінові), якимиобробляютькомплекс антиген-антитіло. Внаслідок цього він під дією ультрафіолетових променів починає світитись зеленим світлом.

У першому випадку говорять про прямий, у другому – про непрямий імунофлуоресцентний метод (рис. 55).

Імунофлуоресцентні методи вживаються для виявлення аутоантитіл до тканиннихіклітиннихантигенів. Використовуючизрізитканин, напредметномусклі можна виявити антитіла до декількох різних антигенів.

З допомогою імунофлуоресцентних методів можна ідентифікувати окремі клітини в суспензії клітин з допомогою виявлення антигенів на поверхні живих клітин. Дляцьогосуспензіюживихклітин, якібулипопередньопофарбованіфлуоресцентними барвниками, пропускають через спеціальний прилад (цитофлуориметр), якийзаміряєінтенсивністьсвітіннякожноїклітиниврізнихобластяхспектра і потім розділяє клітини за параметрами світіння.

Рис. 55. Реакція імунофлуоресценції (прямий і непрямий методи).

Імуноферментні методи (ІФА)

Вімуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один

зреагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежновідсубстратудаєрізнокольоровіпродуктиреакції. Крімпероксидазихрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуваєпопулярностілужнафосфатаза, особливопривикористанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючихантигенів, антитілтаімуннихкомплексів, якімаютьсуттєвезначеннявдіагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченимпероксидазою, потімдоутвореногокомплексу додаютьвідповіднийсубстрат (наприклад, Н2О2, 5-аміносаліциловукислоту). Якщоантигенвідповідаєантитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, протетакареакціявживаєтьсярідкозприводуменшоїчутливостіпорівнянозіншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення (рис. 56).

промивка промивка

3 – антиглобулін, кон’югований з ензимом, зв’язаний з комплексом антиген-антитіло; 4 – внесення субстрату; який розкладається ензимом; 5 – зміна забарвлення в лунці свідчить про присутність ензиму, а значить, відповідно антитіла.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали застосовувати комплексиавідин-біотин-пероксидаза. Технікаїхвикористанняможе бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидазаіавідинпіслязмішування утворюютькомплекси. Дляцьогометодувже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасноможнавиявитидва або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пер- оксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксида- за, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадкахвякостііншогоантитілавикористовують кінські протимишачіантитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в на-

ступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чиантитіло. Доантигена, якийзафіксованийнатвердійфазі, додаютьдосліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, міченіензимом. Післянаступноїінкубаціїіпромиваннядодаютьсубстрат

для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дануметодику, твердофазногонепрямогоімуноферментногометоду, найчастіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є модифікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердо-

му носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироваткизв’язуютьсязантигенами. Післяцьоговносять стандартні специфічні антитіла, міченіферментом. Якщоантитіласироваткихворогозв’язалисьзантигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Длярадіоактивногоміченнянайчастішевикористовуютьдванукліди: тритій – 3H і йод – 125J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників γ -проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваногоантигена, тимменшеміченогоантигеназв’язуєтьсязантитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщененатвердійфазі, інкубуютьздосліджуванимматеріалом, вякомувизначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріаліспецифічногоантигенавменшіймірібудезв’язуватисьзантитіломмічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв’язуєтьсязантигеном. Кількістьміченогоантитілапрямозалежитьвідкількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічнаметодикаможе бути використанаідлядослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergosorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST дляIgE). Залергенами, якіадсорбованінатвердійфазі(фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакціїможнавиявлятинезначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяютьвиявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Протедляїх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

Імуноблотинг

Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелюбіополімеринедоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметрпорматриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень.

Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток –

блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють здопомогоюелетрофорезувгелі. Одержаніфракціїелектрофоретичнопереносять налистокнітроцелюлози(блот), якийзнаходитьсявспеціальнійкамері. Фіксовані блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають радіоактивно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Замість радіоактивної мітки можна використати люмінесцентні антитіла або антитіла, кон’юговані з ферментом. В останньому випадку субстрат для ензиму (хромоген) повинен бути попередньо нанесений на нітроцелюлозну мембрану.

Існуєбагаторізноманітнихметодів, вякихвикористовуєтьсяблотинг, наприклад, дот або спот блотинг, Southern блотинг, Northern блотинг, Western блотинг. Всі вказані методи можна віднести до двох груп: тих, в яких використовується гібридизація нуклеїнових кислот і тих, які базуються на феномені реакції анти- ген-антитіло.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК. Генетичні зонди, що застосовуютьсявтакихреакціяходержуютьшляхомклонуванняплазмід,штучного синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на відміну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділити дві комплементарні ниткиДНКшляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК. Проте кращою міткоюгенетичногозондуєбіотин. Біотин– розчиннийуводівітамінН, вструктурі якогознаходитьсязалишокдеоксиуридинтрифосфата, якийєструктурниманалогом трифосфату тимідину. Завдяки цьому біотин вмонтовується у нитку ДНК на місце тимідину, виконуючи роль маркера. Якщо зонд в досліджуваному матеріалі знайде комплементарнуйомуниткунуклеїновоїкислоти, тойогоможнавиявити, додаючи авідин, зв’язаний з ензимом (пероксидаза хрона). Авідин – білок, який знаходиться в яйці, специфічно здатний зв’язуватись з біотином. Кожна молекула авідину має чотири рецептори, які реагують з біотином. Таким чином, молекули авідину реагуютьзбіотином, якийзнаходитьсявгібридизованомузонді, свідченням чогоєзміна забарвлення, зумовлена дією ензиму на специфічний субстрат. Зонди з біотином можна виявити, використовуючи мічені флуорохромом антитіла проти біотину.

Реакції гібридизації блотингпроводяться намембранах, якімістять мікропори і виготовлені з нітроцелюльози або нейлону.

Вестерн імуноблотинг використовується для виявлення антимікробних, антивірусних і протигрибкових антитіл. З цією метою очищені білки (бактерій, вірусів, грибів) розділяють шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі. В останньому білки мігрують і розділяються один від одного, утворюючи невидимі дуги, які складаються з білків різної молекулярної маси. Після розділення дуги електрофоретично переносять на нітроцелюльозну мембрану, що є тою основою, наякійможнабудевиявитиантитілапротиіндивідуальнихбілків. Мембрануріжуть на смуги шириною в декілька міліметрів перпендикулярно до дуг і інкубують їх певнийчасздосліджуваноюсироваткою, якаміститьантитілапротибілків. Смуги промиваютьдляусуненняантитіл, якінезв’язались, ідодаютьміченуантиглобуліновусироватку. Післячогосмугиповторнопромиваютьдлявидаленняантиглобулінових мічених антитіл і спостерігають вже видимі дуги в тих місцях, де наступила реакція між антигенами і антитілами. У цьому методі можна використовувати мічені ізотопом антитіла (рис. 57).

Однак, як показали численні спостереження кращим маркером є біотин, застосування якого значно підвищує чутливість реакції і вилучає небезпеку, пов’я- зану з радіоактивним випромінюванням. Проте застосування біотину вимагає додаткової інкубації і промивання (одне після додавання авідину, який специфічно зв’язується з біотином; друге після внесення субстрату). В результаті хімічної реакції наступає зміна кольору і дуги стають видимими.

Вестерн імуноблотинг – різнопланова методика, яка вживається для дослідження різних аспектів імунологічної відповіді в процесі розвитку інфекційного