Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Улабораторнійпрактицінайпоширенішимметодомфіксуваннямазківєфламбування – тобто фіксація в полум’ї газового пальника або спиртівки. При цьому мазоктримаютьтаксамо, якпривисушуванніітричіпроводятьйогочерезполум’я. Весь процес фіксації триває 5-6 с, а дія жару – 2 с. Більш тривале фіксування жаром зменшує якість препарату, а недофіксований мазок при наступній обробці змивається і таїть в собі небезпеку зараження.

При вивченні деяких структур мікробних клітин, а також мазків крові, від- битківорганіввикористовуютьтакіфіксуючірідиниякетанол(протягом10-15 хв), метанол (5 хв), ацетон (5 хв), суміш Никифорова (10-15 хв), пари формаліну або осмієвої кислоти (декілька секунд). При такому обережному фіксуванні значно краще зберігаються і виявляються всі структури клітин і бактерій.

Забарвленняпрепаратів-мазків. Морфологіюбактерійвивчають, якправило, на зафіксованих і забарвлених препаратах. Незабарвлені мікроорганізми, за виняткомгрибів, погановидноусвітловомумікроскопічерезїхмалу контрастність. Для фарбування мазків у бактеріологічних лабораторіях широко вживають анілінові барвники. Вони поділяються на кислі, нейтральні та основні. Останні добре забарвлюютьякядернийапарат, такіцитоплазматичніструктури. Позитивнозаряджена фарбуюча частина їхмолекулишвидшеіповнішевступає в сполукузнегативно зарядженою бактерійною клітиною. Кислі ж барвники фарбують мікробів значнослабіше. Здатністьтаіндивідуальнаособливістьбактерійфарбуватисьтими чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

Уповсякденнійлабораторній практиці найчастіше вживають такі барвники: червоні – фуксин основний (діамантфуксин, солянокислий розанілін або парарозанілін), фуксин кислий, нейтральний червоний, сафранін, конго червоний; фіолетові – генціан-, кристал- іметил-віолет; сині– метиленовий і толуїдиновий синій, трипановий голубий; зелені – малахітовий, брильянтовийзелений; жовто-коричневі– везувін, хризоїдин та ін.

Длязабарвленнямазківнеобхідно мати набір фарбуючих розчинівуфлаконахзпіпеткамиігумовими балончиками. Їх зручно розміщувати у дерев’яному штативі(колодцізгніздами). Змивання барвників і прополоскування препаратів роблять за допомогою спеціальних пристроїв (рис. 8).

Запропоновані численні методи забарвлення бактерій. Вони поділяються на прості й складні.

Прості способи забарвлення бактерій

Простий метод забарвлення дає можливість дослідити загальну морфологію мікробів, їх розміри, форму, кількість, локалізацію, взаємне розташування клітин тощо. Але за його допомогою неможливо вивчати внутрішню структуру бактерій та їх різне відношення до декількох барвників.

Простим забарвленням називають таке, при якому застосовують лише один барвник. Найчастіше використовують основний розведений фуксин Пфейфера і лужну метиленову синьку Леффлера. Фуксином фарбують 1-2 хв, а синькою – 3-5 хв. Препарати, що містять, окрім бактерій, тканинні й клітинні елементи макроорганізму, краще забарвлювати метиленовою синькою, яка фарбує фонпрепарату порівняно слабко, а бактерії – значно інтенсивніше.

На зафіксований препарат наносять піпеткою таку кількість барвника, щоб він покривав увесь мазок. Після фарбування препарат промивають водопровідною водою і висушують на повітрі, або притискають фільтрувальним папером, потім проводять над полум’ям, щоб випарувались залишки води. Якщо на препараті залишиться вода, то, з’єднавшись з імерсійною олією, вона утворить емульсію, яка заважатиме чіткому зображенню.

При висушуванні мазків за допомогою листків фільтрувального паперу потрібно кожного разу користуватися новими, оскільки при повторному вживанні переносяться забарвлені бактерії з одного мазка на інший, що може призвести до неправильних висновків.

Виготовлення барвників для простого забарвлення

1. Фуксиносновнийготуютьувиглядіконцентрованогофеноловогофуксину Циля. Він дуже стійкий, може зберігатись протягом декількох місяців. У концентрованому вигляді вживається лише для фарбуваня спор і кислотостійких бактерій. Для простого забарвлення та за методом Грама його розводять дистильованою водою 1:10, отримуючи так званийрозведений, абоводнийфуксинПфейфера. Цейрозчиндуже нестійкийійогоготують безпосередньо перед вживанням.

Спочатку фуксин з кристалами фенолу і гліцерином розтирають у ступці до однорідної маси, потроху додаючи спирт, потім, весь час перемішуючи, доливають дистильовану воду. Розчин витримують при кімнатній температурі протягом 48 год і фільтрують. З нього потім виготовляють водний фуксин.

2. Метиленова синька. Спочатку готують насичений спиртовий розчин метиленовоїсиньки, якийдужестійкий. Призберіганнійогофарбуючівластивості, атакожздатність даватиметахроматичнезабарвленнянуклеїновихсполук(напр. волютиновихзерен) значно підвищується за рахунок утворення азурів.

Насичений спиртовий розчин метиленової синьки

Ізданогорозчинуготуютьлужну метиленову синьку за Леффлером, яку дужешироко використовують для простого методу забарвлення.

Метиленова синька за Леффлером

Лужна метиленова синька за Леффлером, як і її водно-спиртовий розчин, можуть давати забарвлення різної інтенсивності у різних видів бактерій.

ДопростихметодівзабарвленняможнавіднестиінегативнийспосібБуррі. Приньому зарахуноктушістворюютьтемнийфон, абактеріїзалишаютьсянезабарвленими. Длястабільних і чітких результатів необхідно дуже ретельно підготувати суспензію туші. Вибирають найкращі сорти рідкої китайської туші й розводять її дистильованою водою 1:10. Можна натерти сухої китайської туші й довести її до такої ж густоти. Суспензію туші довгоцентрифугуютьпри3 тис. об/хв. Верхнійшарвідсмоктуютьпіпеткоюівнадавленій краплі під імерсійним об’єктивом перевіряють її на відсутність грубих частинок. Якщо суспензія хороша, її натягують у тонкі капіляри по 0,1-0,2 мл, запаюють і стерилізують в автоклаві.

Придослідженнікраплютушізкапіляравипускаютьнапредметнескло, добавляють крапельку матеріалу (рідину з сифілітичної виразки, культуру капсульних бактерій, лептоспір та ін.) і ретельно перемішують петлею. Шліфованим предметним склом зі зрізаними кутами готують тонкий препарат так само, як мазок крові, висушують, не фіксують. Примікроскопії тілабактерій, спірохет, лептоспірвиглядаютьбілими, чіткоокресленими на темному димчасто-сірому фоні. Замість туші можна використати 2-10 % розчини опалового синього, конго червоного, нігрозину, коларголу та ін. В такому разі фон буде мати інший колір.

Необхідно враховувати, що мікроорганізми в таких препаратах не вбиті і можуть стати джерелом зараження, як і в мазках, обережно фіксованих у полум’ї пальника.

При вивченні забарвлених препаратів царства прокаріот виділяють чотири основні форми бактерій:

1) кулясті(сферичні), абококоподібні; 2) паличкоподібні(циліндричні); 3) спіралеподібні (звивисті); 4) ниткоподібні (трихобактерії).

Кокоподібнібактерії(відгр.kokos – зерно, кісточка) маютьправильнукулясту форму діаметром 1,0-1,5 мкм. Деякі з них набувають бобоподібної, ланцетоподібної та еліпсоподібної форми (рис. 9). За способом ділення та взаємного розташування в мазках всі коки поділяють на такі групи:

1.Мікрококи(відлат. мikros – малий). Вониділятьсяводнійплощині, розташовуютьсяпоодинційхаотично; середниххвороботворнихвидівдлялюдининемає.

2. Диплококи(від лат.diplos – подвійний). Ділення їх проходить в одній площині з утворенням подвійних парних клітин, які мають форму квасолі (Neisseria meningitidis), або вістря ланцета (Streptococcus pneumoniae).

3. Стрептококи (від гр. streptos – ланцюг, намисто). Після поділу в одній площинімікробинерозходяться, аформуютьрізноїдовжиниланцюжки, щонагадують намисто. Частина з них є сапрофітами, представниками нормальної мікрофлори людини (напр., ротові стрептококи). Інші види(Streptococcus pyogenes) викликають такі тяжкі захворювання як сепсис, остеомієліт, скарлатину, бешиху,

1,0-10 мкм завдовжки і 0,5-2,0 мкм завширшки (рис. 9). Вони поділяються на бактерії, бацили і клостридії. Власне бактерії (від гр. bacteria – паличка) – мікроорганізми, що не утворюють спор. Бацили (від лат. bacillus – паличка) мають спори, якінеперебільшуютьдіаметрмікробноїклітини. Клостридії(відлат. clostridium – веретеноподібний) утворюютьспори, щоперебільшуютьпоперечнийрозмірклітини і дещо деформують її.

Форма паличкоподібних бактерій може бути овальна, циліндрична, еліпсоподібна, веретеноподібна, увиглядібарабанноїпалички, тенісноїракетки. Їхкінці бувають заокруглені, загострені, булавоподібні, рівні, нібито обрублені тощо. Паличкоподібні бактерії розмножуються шляхом поперечного поділу.

Зааналогієюзкоками, залежно від взаємногорозташуваннявмазках, паличкоподібні мікроорганізми поділяють на такі групи:

1.Монобактерії при поділі розташовуються поодинці (Escherichia coli, Salmonella typhi).

2.Монобацили також розташовані поодиноко, але мають спори (Bacillus subtilis, Clostridium tetani).

3.Диплобактерії розташовуються в мазках парно (Klebsiеlla pneumoniae).

4.Диплобацили – парне розташування спорових мікроорганізмів.

5.Стрептобактерії – безспорові палички, які розташовані у вигляді лан-

цюжків (Haemophilus ducrey).

6.Стрептобацили– споровімікроби, щорозташовуютьсяланцюгом(Bacillus anthracis).

Спіралеподібні (звивисті) бактерії (рис. 9) за кількістю і характером за-

витків, а також за діаметром клітини поділяють на три групи:

1.Вібріони (від гр. vibrio – звиваюсь) мають одну характерну зігнутість, яка не перебільшує чвертівиткаспіралі, алеможематиіформу прямої палички. Прикладом хвороботворного виду є Vibrio cholerae.

2.Спірили (від гр. speira – завиток, спіраль) – товсті звивисті мікроорганізми, які маютьмалу кількість завитків (2-3), що надає їм форму штопора. Патогенна для людини Spirillum minor викликає содоку (хворобу укусу щурів). До цієї групи мікробів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спри- чинятиулюдинизахворюванняшлунково-кишковоготракту, сечостатевихорганів.

3.Спірoхети(відгр. speira – завиток, haite – волосся) – тонкіштопороподібні бактерії, які мають велику кількість завитків. Серед них є хвороботворні види

(Treponema pallidum – викликає сифіліс, Borrelia recurrentis – поворотний тиф, Leptospira interrogans – лептоспіроз).

Ниткоподібні бактерії належать до вільноіснуючих сапрофітних мікроор-

ганізмів (напр. залізо- і сіркобактерії). Для людини вони не патогенні і в медичній мікробіології не вивчаються.

Окрім того, останнім часом виявлені мікроби, які мають трикутну, квадратну, зіркоподібнуітарілкоподібнуформи. Вониберутьучастьупроцесахбіодеградації різноманітних природних сполук.

Спірохети. Особлива група грамнегативних звивистих бактерій, що мають вигляд довгих тонких, спірально закручених ниток, дістала загальну назву спірохет. Довжина їх коливається в межах 7-50, товщина – 0,3-0,5 мкм. Вони належать до порядку Spirochaetales, до складу якого входять три патогенних для людини роди: Treponema, Borrelia, Leptospira. Між собою вони відрізняють рядом ознак.

Центральною структурою спірохет є цитоплазматичний циліндр, що має постійну спіралеподібну форму. Зовні він покритий цитоплазматичною мембраною і клітинною стінкою. Органом руху спірохет є периплазматичний джгутик (джгутики), розташований між циліндром і цитоплазматичною мембраною. Спірохети мають різні типи рухів: згинальний, поступальний, обертальний, маятникоподібний.

Число і форма дрібних завитків характерні для кожного виду спірохет. Вони формуютьзавиткипершогопорядку. Утрепонемє8-14 такихзавитків, однакових за формою та величиною. Лептоспіри мають 12-18 дуже дрібних первинних завитків. На їх кінцях є вторинні завитки, які надають їм S- або С- подібної форми і роблять їх схожими на гачок (рис. 10).

Патогенними представниками для людини є Treponema pallidum, яка викликаєсифіліс, Borrelia recurrentis – збудникепідемічногоповоротноготифу, Leptospira interrogans, що спричиняє лептоспіроз.

Методи виявлення спірохет у досліджуваному матеріалі можуть бути різними. При діагностиці сифілісу, бореліозу і лептоспірозу найчастіше використовують метод темного поля. На тонких предметних скельцях (1,0-1,2 мм) виготовляють з матеріалу надавлену краплю і вміщують на предметний столик. При дослідженні використовують темнопольний конденсор. Дуже важливо при цьому досягти точної центровки всіх оптичних систем мікроскопа і встановити освітлення за методом Келлера. На верхню лінзу конденсора необхідно нанести краплю кедрового масла, уникаючи бульбашок повітря. Значно рідше використовують

стістю і брунькуванням. Паличкоподібні форми схожі за будовою до звичайних бактеріальних клітин, можуть мати цитоплазматичні влкючення. Актиноміцети належатьдородинActinomycetacae, Nocardiaceae іStreptomycetaceae, якіохоплю-

ють понад 400 видів. Переважна їх більщість є сапрофітами. Вони вільно живуть угрунті, забезпечуючийогородючістьісвєріднийзапах. Частозустрічаютьуводі, повітрі інших об’єктах зовнішнього середовища. Багато з них є продуцентами антибіотиків (тетрациклін, стрептоміцин та ін.).

До патогенних представників відносяться Actinomyces israeliі, A.bovis, A.naeslundii, які викликають у людей актиномікоз, атакож Nocardia asteroides, що спричиняє нокардіоз. Окремі представники роду Streptomyces можуть викликати у людини міцетому ступні.

Морфологічне дослідження актиноміцетів можливе як у нативних (нефарбованих) препаратах, так і в мазках, забарвлених за Грамом. У першому випадку гній чи виділення з нориць обробляють 15% розчином КОН, потім відбирають окремі шматочки (пісчинки розміром із макові зерна), кладуть їх між двома предметними скельцями й обережно роздавлюють. Отримують два препарати-мазки, які краще мікроскопувати за допомогою фазово-контрасного чи аноптральногомікроскопа. При цьому актиноміцети розташовуються у вигляді друз (своєрідних скупчень переплетених гіф, які радіально розходяться як промені сонця). Забарвленні мазки мікроскопують як звичайно.

Патогенні гриби. Гриби являють собою особливу групу одноклітинних і богатоклітинних еукаріотів (понад 100 тис. видів), які широко розповсюдженні в природі. Біля400 видівєхвороботворнимиіспричиняютьулюдинигрибковіхвороби (мікози).

Клітини більшості грибів маютиь щільну оболонку, до внутрішнього шару якоїприлягаєцитоплазматичнамембрана. Вцитоплазміміститьсяоднеабодекілька ядер, вакуолі, мітохондрії, мікросоми, лізосоми, рибосоми, комплексГольджі, різноманітні влючення. Молоді клітини мають яйцеподібну форму, зрілі стають циліндричними а старі – булаво-, грушота веретеноподібними. Основу тіла гриба становлять особливі трубчасті нитки – гіфи, сукупність яких називають міцелієм. У гіфів нижчих грибів починають появлятись перегородки, які є характерною ознакою у вищих грибів. Кінцеві розгалуження міцелію мають своєрідну форму, за

якоюможнадиференціюватиокремі види. Це органи плодоносіння грибів, які мають ендоабо екзоспори. Прикладомутворенняендоспор може бути мукорова пліснява Mucor mucedo, яка має несептованийміцелій, одноклітиннийплодоносящий гіф спорангієносець, на кінці якого знаходисться круглий спорангій, наповненийендоспорами (рис. 11, 3). Ектоспори можна

спостерігати у лійкової пліснявиAspergillus niger, від плодоносящого гіфа якого – конідієносця – немов би відшнуровуються спори (конідії), що розташовуються радіальноінагадуютьструменіводи, якірозбризкуютьсяізсадовоїлійки(рис. 11, 2). У китиценосного грибаPenicillium glaucum міцелій і конідієносець багатоклітинний, плодоносне тіло нагадує пензлик (рис. 11, 1).

Гіфи міцелію дерматофітів можуть нагадувати роги оленів, канделябри, булаву, гребіньпівнятощо. Будоваорганівплодоносіння, характерплодовихтіл, їхформа, велечина й морфологічні особливості покладені в основу класифікації грибів.

Виділяють нижчі та вищі гриби. До нижчих належать хітридіоміцети, ооміцети, зигоміцети; до вищих – аскоміцети, базидіоміцети та дейтероміцети. Нижчі гриби, як правило, непатогенні для людини. Однак окремі види мукорової, аспергілової та пеніцилової плісняви можуть уражати шкіру, очі, слухові проходи, легені, шлунково-кишковий тракт.

Велике значення в медичній практиці мають гриби роду Candida. вони часто єпредставникаминормальноїмікрофлорилюдини. Алепринераціональномузастосуванні антибіотиків, імунодефіцитах та авітамінозах здатні викликати серйозні захворювання – кандидомікози. Ще більшого значення в грибковій патології людини набула група недосконалих грибів-дейтероміцетів. Вони можуть викликати епідермофітію, мікроспорію, трихофітію, фавус та ін.

Однакгрибимаютьівеликекориснезначення. Їхвикористовуютьухарчовій, парфюмерній, хімічнійпромисловості. ІзокремихвидівтакихродівякPenicillium і Cephalosporium виготовляють антибіотики (пеніциліни, цефалоспорини).

Мікроскопічне дослідження грибів проводять як у нативному (незабарвленому) стані, такізадопомогоюрізнихметодівфарбування. Частинку подрібненогодосліджуваногоматеріалунаносятьнапредметнескло, добавляютьоднукраплю 30 % розчину КОН, злегка підігрівають над полум’ям пальника до появи білого обідка по периферії краплі. Після цього препарат накривають покрівним скельцем і мікроскопують за допомогою сухих об’єктивів при опущеному конденсорі і звуженій діафрагмі. Ще краще досліджувати нативні препарати під фазово-кон- трастним або аноптральним мікроскопом.

При дослідженні грибів у забарвленому стані після дії розчину лугу мазок промивають водою, висушують, фіксують і забарвлюють метиленовим синім або фуксином.

Рикетсії. До групи рикетсій належать унікальні мікроорганізми, в яких поєднані морфологічні властивості бактерій і біологічні властивості вірусів. З першими їх єднає типова будова клітин, а з вірусами – облігатний внутрішньоклітинний паразитизм.

Рикетсії мають типову для грамнегативних бактерій клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану, ядерний апарат, не обмежений від цитоплазми будь-якою оболонкою. Вони не утворюють спор і капсул. За Здродовським розрізняють 4 морфологічних типи рикетсій (рис. 12):

1 – дрібні овоїдні кокоподібні клітини розміром біля 0,5 мкм, часто утворюють диплоформи у вигляді гантель;

людинитакірикетсіозияквисипнийтиф, марсельськалихоманка, лихоманкаЦуцугамуші, Ку-гарячка та ін. Збудниками цих захворювань відповідно є Rickettsia prowazekii, R. typhi, R. tsutsugamushi, Coxiella burnetii. Велику роль у передачі та розповсюдженнірикетсіозіввідіграютьрізнікровососнікомахи(воші, блохи, кліщі).

Морфологію рикетсій вивчають під світловим мікроскопом у препаратах забарвлених за Романовським-Гімзою, де вони набувають рожево-червоного кольору. Дужезручний і простий спосіб їх забарвлення за Здродовським: тонкий зафіксований мазок фарбують розведеним карболовим фуксином (10-15 крапель на 10 млдистильованоїводи) протягом5 хв, потімзлегказнебарвлюютьпрепарат0,01% соляною кислотою і додатково 30 сек фарбують метиленовим синім. Рикетсії стають рубіново-червоними, цитоплазма клітин макроорганізму голубою, а ядра – синіми.

Хламідії. До патогенних бактерій роду Chlamidia віднесені грамнегативні нерухомі мікроорганізми, що не утворюють спор і капсул. Вони є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, не ростуть на штучних середовищах. Протягом свого життєвого циклу хламідії проходять три стадії:

1)дрібні елементарні тільця розміром 0,2-0,5 мкм, які мають компактний нуклеоїд і тришарову ригідну оболонку;

2)крупні ретикулярні тільця (0,8-1,5 мкм) сферичної форми з фібрилярним нуклеоїдом і тонкою клітинною стінкою;

3)проміжні тільця, що являють собою перехідні морфологічні форми між елементарними і ретикулярними тільцями.

Елементарні тільця є інфекційною, а ретикулярні – вегетативною формою

цих бактерій.

Окремівидихламідій(Chlamidia trachomatis, C. psittaci) викликаютьулюдини трахому, орнітоз, паховий лімфогрануломатоз, уретрити, кон’юнктивіти, поліартрити, менінгоенцефаліти та інші захворювання.

Длямікроскопічногодослідженняхламідійвінфікованихклітинахітканинах організмувиготовленімазкизабарвлюютьзаметодомРомановського-Гімзи. Тільця