Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Серологічний метод базується на виявленні специфічних антитіл у сироватці крові хворих до певного збудника. Для цього використовують різні імунологічні(серологічні) реакції: аглютинації, преципітації, зв’язування комплементу тощо. Так, наприклад, при черевному тифі часто ставлять реакцію аглютинації Відаля, при бруцельозі – реакцію Райта, при хронічній гонореї – реакцію зв’язування комплементу Борде-Жангу та ін.

Біологічний(експериментальний) методполягаєузараженнічутливихлабораторнихтваринвиділеноючистоюкультуроюзбудника, досліджуванимматеріаломабовведеннібактерійнихтоксинівівідтвореннітиповоїкартинизахворювання. Для цього використовують білих мишей, щурів, гвінейських свинок, кроликів. Цим методом визначають і вірулентність мікробів. З діагностичною метою біологічну пробу часто використовують при чумі, сибірці, туляремії, правці, ботулізмі анаеробній газовій інфекції, кліщовому енцефаліті тощо.

Алергічний метод дає змогу встановити діагноз за допомогою внутрішньошкірних алергічних проб, які виявляють стан підвищеної чутливості до збудника чипродуктівйогожиттєдіяльності(алергенів). Цимметодомширококористуються придіагностицітуберкульозу(пробаМанту), бруцельозу(пробаБюрне), туляремії та багатьох інших хвороб.

Дляглибокогорозуміння, засвоєнняілогічногозастосуваннябактеріоскопічногометодудіагностикиважливезначеннямаєфундаментальневивченняморфологі й ультраструктури мікробів, методів їх простого й складного забарвлення, виявлення окремих структур і включень у бактерійній клітині. З цією метою в лабораторії широко використовують сучасні мікроскопи — високоінформативні оптичні прилади.

Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, тому побачити їх неозброєнимокомнеможливо. Утой жечасморфологіямікробів, їхрозміри, форма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою класифікації. Зважаючинаце, однимзнайважливішихметодівдослідженнябудови мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів дослідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як темнопольна, фазово-контрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна, люмінесцентнатаін. Прививченніанатоміїйультраструктуривірусіввикористовують електронну мікроскопію.

Сучаснапромисловістьвипускаєбагатовидівмікроскопівзалежновідїхпризначення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користуються мікроскопами МБР-1, МБР-3 (рис. 1).

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До механічноївходятьштатив, тубус, револьвер, предметнийстолик, макроймікрогвинт, до оптичної – об’єктиви й окуляри, до освітлювальної – дзеркало й конденсор.

Предметний столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знаходитьсяотвір, надякимрозміщуютьпредметнесклозпрепаратом(мазком). Убільш досконалихмікроскопахєдужезручніпредметністолики, якізадопомогоюспеціальних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикулярних напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (× 8, × 40) та імерсійні(× 90, × 120). Сухиминазиваютьтакіоб’єктиви, міжфронтальноюлінзою яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, у зв’язку з різницею показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедрова, персикова олія чи “імерсіол”, коефіцієнт заломлення світла яких такий самий, як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переважно імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена такимиявищами, якхроматичнайсферичнааберації, дифракціятаін. Якщообидва види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній системі і його усунути або принаймі зменшити практично неможливо. Дифракція в значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вирахувати за формулою:

де А – роздільна здатність; 0,61 – коефіцієнт геометричних величин при вирахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; λ – довжина світлової хвилі; n· sinα – постійнавеличинадлякожногооб’єктива, яканазиваєтьсячисловою або нумеричною апертурою. У сучасних сухих об’єктивах вона не перебільшує 0,95, а в імерсійних – від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність дорівнює:

A = 0,6110,,6055 = 0,2мкм

Отже, прикористуваннінавітьнайкращимиімерсійнимиоб’єктиваминеможливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів. Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при використанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить від об’єктива, не додаючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими збільшеннями: × 7, × 10, × 15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в конденсор, а через нього – в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала увігнутий, другий– плоский. Примікроскопуваннізконденсоромнеобхіднокористуватисьлише плоскимдзеркалом. КонденсорАббескладаєтьсязсистемилінздлязбиранняпучка променівводнійточці(фокус), яказнаходитьсявплощинідосліджуваногопрепарату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня предметногостолика, зштучним– опускатидоти, покизображенняджереласвітла не з’явиться в площині препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів конденсор також опускають.

Об’ємсвітлавідповіднодопотребдослідженнярегулюєтьсядіафрагмою, яка знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно дозіниціока(звідсиназваіріс-діафрагма). Забарвленіпрепаратирозглядаютьпри відкритій, а незабарвлені – при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується зображеннятарозширюютьсямежівидимості. Першедосягнуто випускоммікро- скопів-бінокулярів, друге – дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночасно досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших клітиноптичнапромисловість випускає більшдосконалі мікроскопи. Однимізних

світлі, яке проходить, у темнопольному – при боковому освітленні. Для мікроскопії в темному полі використовують замість конденсора Аббе спеціальний парабо- лоїд-конденсор(кардіоїд-конденсор), вякомубоковаповерхнядзеркальна, ацентральначастинанижньоїлінзизатемнена, врезультатічогоутворюєтьсятемнеполе зору. Яскравібоковіпромені, відбиваючисьвіддзеркальноїповерхні, фокусуються вплощиніоб’єкта, алевочімікроскопістанепотрапляють. Воб’єктивпроникають лишетіпромені, яківідбиваютьсячастинкамипрепарату завдякизаломленнюабо дифракції. Отже, на темному полі зору мікробні клітини й інші дрібні частинки виглядають дуже яскравими. Картина нагадує миготливі зірки на темному небі.

Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02- 0,04 мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому темнопольниймікроскопчастоназиваютьультрамікроскопом. Мікроскопіювтемному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення збудниківсифілісу, лептоспірозу, поворотноготифу. Алеприцьомунеможнадобре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані видозміненіметодиоптичноїмікроскопії: фазово-контрастна, аноптральнаталюмінесцентна.

Фазово-контрастнамікроскопія– спосібмікроскопічногодослідженняпрозорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникних променів. У різних ділянках клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неоднакові. Цірізниціуфазахніорганзору, ніфотоплівка не помічають. Алеїхможна

тиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні переваги перед фазово-контрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазово-контрастної, при якій використовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричне- вим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву основну частину дифрагованого світла, у той час як темний шар кільця затримує небажане периферійне дифраговане світло. За рахунок цього в значній мірі усувається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких малоконтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віруси. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стереоскопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набувають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія базується приблизно на тих же принципах, щойфазово-контрастна. Аленавідмінувідостанньоївонадаєможливістьвивчати деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається завдяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку об’єкта, а другий– позанею. Вокуляріобидвапроменіз’єднуютьсятаінтерферують між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим самиммасу різних структур у клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентрацію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційнумікроскопіювикористовуютьуцитологічнихдослідженнях, при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпростіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі настає через світіння самого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовими променями. Метод побудований на використанні явища флуоресценції. Оскільки більшість хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочатку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найчастіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, корифосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного тиску, пропускаютьчерезсиньо-фіолетовийсвітлофільтр. Піддієютакогоопроміненнязабарвленіфлуорохромомбактеріїпочинаютьсвітитисячервоним, зеленим, жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифос-

фіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Методлюмінесцентноїмікроскопіїнабагаточутливішийпорівнянозіншими мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збудника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції диференціюють окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Використання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення, високаконтрастність, можливістьдосліджуватиякживі, таківбитімікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби, якімістять певні антигени. Дляїхвиявленнянеобхідно матиспецифічні люмінесцентні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей ме- тодуспішновикористовуютьдляекспрес-діагностикибагатьохбактерійнихівірус- них захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18, ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроскопами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів, фотонасадку, даєзмогупроводитиодночаснокомбінованіспостереження: люмінесцентне – при освітленні препарату зверху і фазово-контрастне – в проникному світлі (рис. 3).

Електроннамікроскопія. Длявивченнябудовимікроорганізмівнасубклітинному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку електронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис. до 5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі (растрові) йкомбінованіелектроннімікроскопи.

Принципова схема просвічуючого електронногомікроскопамалочимвідрізняєтьсявід звичайного оптичного. Можливості світлового мікроскопа обмежені не якістю лінз, а вели- коюдовжиноюсвітловиххвиль(0,29-0,8 мкм). Мала довжина хвилі електронів (0,0002 мкм і навіть менше) дозволяє значно збільшити роздільну здатність електронного мікроскопа. Замість світла в ньому використовують потік електронів, джереломякихєвольфрамованитка, що нагрівається електричним струмом (електронна пушка). Роль лінз оптичного мікроскопа виконує кругове електромагнітне поле. Пучки електронів, проходячи через досліджуваний об’єкт, відхиляються під різними

кутами залежно від неоднакової товщини та Рис.3. Люмінесцентний мікроскоп.

щільності різних ділянок препарату і потрапляють в об’єктивну лінзу. В ній появляється перше корисне збільшення об’єкта.

Після об’єктивної лінзи електрони потрапляють у проміжну лінзу, яка служить для плавного збільшення зображення. Проекційна лінза створює кінцеве збільшенезображенняоб’єкта, якенаправляється нафлуоресціюючий екран. Завдякивзаємодіїшвидкихелектронівзлюмінофоромекранувиникаєвидимезображення об’єктів. Після наведення чіткості проводять фотографування.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об’єктів дослідження. Необхідна спеціальна фіксація тканин або бактерій, їх ретельне зневоднення, заливка в епоксидні смоли, виготовлення ультратонких зрізів. Для підвищення чіткості зображення використовують методи позитивного й негативного контрастування та відтінення.

Досліджуванийоб’єктспочаткузафіксовуютьособливимифіксаторами, потім наносятьнанадзвичайнотонкуколодієвуабоцелюлознуплівку, вміщенунаспеці- альнусіточку-підкладку. Принапиленнінаповерхнюпрепаратупідпевнимкутом у вакуумі наносять тонким шаром важкі метали, хром, золото, паладій. Розпорошені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються рельєфно й контрастно (позитивне контрастування). Негативне контрастування зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприклад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осідаючи навколо білкових частинок дос-

ліджуваногооб’єктайзаповнюючивсіпроміжки міжними, атомиважкихметалів“забарвлюють” фон, на якому виступають найменші деталі будови мікроорганізмів.

Широкотакожвикористовуютьультратонкі зрізи клітин, бактерій, що дає змогу вивчити їх структуру на субклітинному й молекулярному рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промисловість випускає багато моделей електронних мікроскопів (рис. 4), які мають величезні можливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методиелектронноїмікроскопіїпривелидо великих успіхів у розвитку таких наук як цитологія, бактеріологія, генетика і, особливо, вірусологія. Успішнорозвиваєтьсяімуннаелектронна мікроскопія, яка дає змогу визначити родову належність вірусів, що використовується для

експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагностики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.

Розділ 3

МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

У даному розділі розглядаються методи дослідження морфологічних особливостей основнихпредставників різноманітних мікроорганізмів: бактерій, актиноміцетів, грибів, найпростіших, рикетсій. Всі вони належать до одноклітинних організмів, мають різну форму і внутрішню структуру, які досліджують за допомогою вищеописаних методів мікроскопії.

Виготовлення мазків і методи їх забарвлення

Бактеріоскопічнедослідженнябудь-якогоклінічногоматеріалу, дезнаходяться збудники інфекційних хвороб, є однією з найпоширеніших мікробіологічних методик. У лабораторній практиці частіше проводять мікроскопію фіксованих забарвлених мазків і рідше нативних препаратів у вигляді стисненої чи висячої крапель. Їхвиготовляютьназаздалегідьпідготовленомуіоснащеномуробочомумісці.

На столі повинні бути лише необхідні матеріали, інструменти і пристрої: клінічнийматеріал(кров, гній, слиз, харкотиння, сеча, випорожненнятаін.), культури мікроорганізмів у пробірках або чашках Петрі, бактеріологічні петлі, піпетки, пінцети, штативи, предметні скельця, газовий пальник, ізотонічний розчин хлориду натрію, розчини барвників, лотки з рейками для фарбування мазків, промивалка з водою, фільтрувальний папір, банка з дезрозчином для знезараження використаних препаратів і піпеток. Доцільно в лабораторії обладнати окремий столик для забарвлення мазків.

Препарати-мазкивиготовляютьнапредметнихскельцях, товщинаякихчерез оптичнівластивостіконденсораАббенеповиннаперебільшувати1-1,2 мм. Скельця необхідно заздалегідь ретельно знежирити. Для цього протягом доби їх витримують у концентрованій сірчаній кислоті або кип’ятять у суміші 6 % розчину двохромового калію і сірчаної кислоти, ретельно промивають проточною водою, переносять у банку з 96° спиртом, де вони зберігаються до використання. Можна знежиреніівитриманівспиртіскельцявитертинасухолляноютканиноюізберігати в герметично закритій скляній банці. Крапля води, нанесена на холодне знежирене скло, повинна рівномірно розтікатися, а не збиратись у дрібні крапельки.

Виготовленняпрепаратів-мазківізщільного(густого) клінічногоматеріалу або з культури на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце про-

водять через полум’я газового пальника і після охолодження кладуть на робоче місце. Длявиготовленнямазкаматеріалчикультуру берутьбактеріологічноюпетлеюзплатиновогоабохромонікелевого дроту довжиною5-6 см. Петлюзакріплюютьупетлетримачі. Кінецьїїзгинаютьувиглядізамкнутогокільцярозміром1х1,5 чи 2х3 мм. Для деяких робіт потрібно мати цей інструмент у вигляді голки, коли кінець не згинають у кільце, а залишають прямим (рис. 5).

Бактеріологічну петлюпрожарюютьуполум’ї, тримаючиїїяколівець вертикальноуправійруці. Два-триразипроводятьчерезполум’яінижнютретинупетле-

чикультуроюмікроорганізмів. Відкриваютьпробіркуіздотриманнямусіхправил, охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість матеріалу чи культури. Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив. Взятий матеріал (або культуру) наносять на скло біля краплі фізрозчину і, поступово розтираючи йоготаемульгуючивкраплі, готуютьтонкий, рівномірниймазококруглоїчиоваль- ноїформидіаметром1-1,5 см. Післяцьогопетлюпрожарюютьіставлятьуштатив.

Виготовлення мазків із рідкого клінічного матеріалу або з культури на рідкому середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краплю досліджуваного матеріалу або культури з рідкого середовища із дотриманням правил стерильності, як вище описано. Взятий матеріалнаносятьнапредметне скельцеіроблять рівномірний тонкий мазок.

Якщо для забору матеріалу використовують стерильну пастерівську піпетку, її також тримають у правій руці і проводять через полум’я перед внесенням у пробірку. Тонкийкінчикпіпеткипісляохолодження біля стінки пробірки занурюють у рідкий досліджуваний матеріал чи бульйонну культуру, тримаючи верхній кінецьїївідкритим. Післяпопаданнявпіпеткудосліджуваногоматеріалучикультури верхній кінець її закривають вказівним пальцем, виймають з пробірки. Останню закривають і ставлять у штатив. На поверхню предметного скла з піпетки випускаютькраплюматеріалуіопускаютьїївдезрозчин. Простерилізованоюбактеріологічною петлею роблять мазок.

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. При готуванні мазків із ма-

теріалів, які погано розтираються (гній, харкотиння), використовують два предметних скла. Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею абопастерівськоюпіпеткоюнаносятьнасерединузнежиреногопредметногоскла і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залишалась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють дослі-