Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

хламідій фарбуються в голубий або фіолетовий колір. Їх можна виявити і в нативнихпрепаратах(надавленакрапля) задопомогоюфазово-контрастноїмікроскопії.

Мікоплазми. Патогенні мікоплазми представляють собою групу унікальних дрібних поліморфних мікроорганізмів, які не мають ригідної клітинної стінки. Вони виглядають як сферичні або овоїдні тільця діаметром 0,1-0,2 мкм, або як кулясті форми розміром до 1,5 мкм. Рідше зустічаються нитковидні клітини довжиною до 100-150 мкм, які здатні галузитись.

Клітини мікоплазм не мають типової для бактерій оболонки. Вони оточені лишетришаровоюцитоплазматичноюмембраною. Удеякихізнихзовнішнійшар мембрани значно товстіший і нагадує капсулу. У цитоплазмі містяться нуклеоїд, рибосоми, кільцеподібні мембрани, які зв’язані з ядерним апаратом. Спор і джгутиків не утворюють, грамнегативні.

Мікоплазмичастознаходятьсявгрунті, стічнихводах, паразитуютьворганізмі багатьохвидівтварин. Улюдинивониспричинюютьпневмонії, бронхіоліти, ангіни, уретрити, простатити, артрити, ендокардити тощо. Найчастіше захворювання викликають Micoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.

Морфологію мікоплазм досліджують у живому стані в препаратах надавленої краплі під фазово-контрастним мікроскопом або за допомогою електронної мікроскопії ультратонких зрізів їх клітин. При вивченні мікоплазм у забарвлених мазках краще користуватись методом Романовського-Гімзи.

Патогеннінайпростіші. Протисти, абонайпростіші, – цевисокоорганізовані одноклітинні еукаріотичні організми тваринного походження. Вони належать до типуProtozoa і, відповідно, класівсаркодових, джгутикових, споровиківтаінфузорій.

Будова їх складніша за бактерійну клітину. Їх розміри коливаються від 2 до 150 мкм. Вони мають чітко уособлене ядро або декілька ядер з типовою двоконтурною оболонкою (каріолемою), пронизаною порами. В цитоплазмі багатьох найпростіших розрізняють дві частини – більш щільну гомогенну ектоплазму і більш рідку внутрішню ендоплазму. Досить часто самий поверхневий шар ектоплазми становиться ще більш ущільненим і утворює периферійну плівку, або пелікулу, яка являє собою особливий вид міцної еластичної мембрани, що надає клітині постійної форми і виконує захисну функцію. Окрім того у деяких видів є парні фібрили і мінеральний скелет.

Цитоплазманайпростішихміститьвеликукількістьжиттєвоважливихструктур: ендоплазматичний ретикулюм, мітохондрії, пластинчастий комплекс (аппарат Гольджі), лізосоми, рибосоми, різноманітні вакуолі.

Багато видів найпростіших здатні активно рухатись. У одних форм рух здійснюєтьсязарахунокпсевдоподій(амеби), уіншихзадопомогоюджгутиківабовійок.

Найпростішімаютьскладніциклирозвитку. Вониздатнірозмножуватисьпростим (безстатевим) і множинним поділом або іх поєднанням (плазмодії малярії).

При несприятливих умовах деякі види (амеби, лямблії, балантидії) перестають живитися, втрачають органелли, покриваються товстою оболонкою і перетворюються в цисти, що є своєрідною захисною реакцією. Саме цисти відіграють велику роль у розповсюдженні протозойних захворювань.

Найпростішіширокорозповсюдженнівприроді. Більшістьзнихнепатогенні для людини. Однак деякі представники мають високі інфекційні властивості і можуть викликати амебіаз, трипаносомоз, лейшманіоз, урогенітальний та кишковийтрихомоноз, малярію, балантідіаз. Всіцізахворюванняхарактеризуютьсятривалим і важким перебігом, ураженням числених органів і систем.

Мікроскопічне дослідження найпростіших направлене на виявлення їх у нативних і забарвлених препаратах-мазках. Найчастіше для фарбування останніх використовують методи Романовського – Гімзи, Лейшмана, Гейденгайна. В крові паразитів виявляють шляхом виготовлення й забарвлення товстої краплі і тонких мазків (плазмодії малярії, трипаносоми, рідше – лейшманії). У фекаліях, дуоденальномувмісті, мазках із статевихорганіввиявляютьамеби, балантидії, лямблії, трихомонади. Детальніше методи виявлення найпростіших та лабораторна діагностика протозойних захворювань викладені у 18 розділі.

Складні методи забарвлення бактерій

Складні (диференціюючі) методи забарвлення базуються на фізико-хімічних особливостяхбудовимікробнихклітин. Сутьїхполягаєуфарбуваннімазкадвома барвниками, одинзякихєосновним, другий– доповнюючим(контрастним). Після дії першого барвника мазок знебарвлюють кислотою, лугом, спиртом або ацетоном. Деякімікроорганізмилегко, іншіважкознебарвлюються. Однізнихєкислотоіспиртостійкими, другітількикислотостійкими. Спорибактерійдужеважкопіддаються дії знебарвлюючих речовин, вони водночас є і фарбостійкими об’єктами.

Складні методи забарвлення вживають для детального вивчення структури бактерійних клітин, а також для характеристики і диференціації одних мікроорганізмів від інших. Отже, вони мають важливе діагностичне значення. У лабораторній практиці найчастіше використовують складні методи Грама, Ціля-Нільсе- на, Нейссера, Буррі-Гінса та ін.

Забарвлення за Грамом

Цей метод розробив Кристіан Грам у 1884 р. Серед складних методів фарбування він є найбільш універсальним. Він має важливе диференціально-діагнос- тичне значення, оскільки допомагає визначати таксономічне положення тих чи інших бактерій.

Особливості забарвлення за методом Грама дозволяють поділити всі мікроорганізми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапляються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризують як грамваріабельні.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних мікробів здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином у червоний колір.

Догрампозитивнихвідносятьсястафілококи, стрептококи, бацили, клостридії, дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативними є нейсерії (менінго- і го-

нококи), кишкові палички, сальмонели, шигели, рикетсії, всі звивисті бактерії (вібріони, спірили, спірохети, лептоспіри).

Механізм забарвлення за Грамом досить складний і ще остаточно не вивчений. Грампозитивні бактерії мають товсту клітинну стінку, яка складається з 5-6 шарів пептидоглікану (муреїну) та полімерів тейхоєвих кислот. Ці структури легко сприймають і міцно утримують фарбуючий комплекс генціанвіолет + йод і при дії спирту протягом 30-60 с не знебарвлюються. Грамнегативні бактерії мають значнотоншуоболонку, щоскладаєтьсяз1-2 шарівпетидоглікану, неміститьтейхоєвих кислот, а, отже, не втримують комплекс основного барвника при знебарвленні спиртом. При додатковій обробці мазка фуксином Пфейфера вони фарбуються в червоний колір. Саме в цьому полягає основний механізм забарвлення за методом Грама. Окрім того, різне забарвлення мікроорганізмів пов’язане з більш високою концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнату магнію в клітинах грампозитивних бактерій, більш кислим значенням рH і різним співвідношенням РНК:ДНК у цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1).

Виготовлення реактивів для забарвлення за Грамом. Найчастіше в лабораторії готуютьтакібарвники: 1) феноловийгенціанвіолет, 2) розчинЛюголя, 3) фуксинПфейфе-

Феноловий генціанвіолет готують так само, як і феноловий фуксин Циля. Генціан фіолетовий можна замінити кристалвіолетом, або водним розчином метилвіолету, який є досить стійким. Його готують за таким прописом:

Спочатку йодидкаліюрозчиняють у невеликій кількості води, потім всипають кристалічний йод, після розчинення якого добавляють дистильовану воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера готують із концентрованого фенолового розчину цього барвника, розводячи його в 10 разів дистильованою водою. Необхідно використовувати лише свіжовиготовлений барвник.

Техніка забарвлення. Найбільш поширений, так званий стандартний спосіб забарвлення за Грамом, проходить у декілька етапів:

1. Нафіксованийжароммазоккладутьтрохикоротшуівужчувідпредметногоскласмужкуфільтрувальногопаперу. Зверхунанеїнаносятьдостатнюкількість

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудникапроказивикористовують метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розведеним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприймають забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу ЦиляНільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

Фільтрувальнийпапірпросочуютьконцентрованимрозчином фуксинуЦиля, висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дистильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним методом Циля-Нільсена.

Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним із основних і найпоширені-

ших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фарбуються різні структурні елементи паразитів крові – малярійних плазмодіїв, трипаносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм, спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового синього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосередньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барвника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і висушуютьнаповітрі. Приготованийрозчиннаносятьнамазок, ащекращепредметне скельце з мазком опускають у склянку з барвником. Забарвлення триває від 30 хв додвохібільшегодин. Товстікраплікровіфарбуютьпротягом30 хв. Потімбарвник зливають, препаратипромиваютьводоюідобревисушуютьнаповітріувертикальномуположенні. Мікроскопіюпроводятьізвикористаннямімерсійнихоб’єктивів.

Будучи в розчині синьо-фіолетовим, поліхромний барвник РомановськогоГімзи фарбує цитоплазму в голубийколір, аядраклітин, тілабактерій, їхкапсули, слиз– у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлю- ютьсявтемнийчервоно-фіолетовийколір, аволютиновізерна– увишнево-черво- ний; цитоплазма має рожевий колір.

Забарвлення окремих структур мікробної клітини

З науковими й діагностичними цілями в бактеріологічних лабораторіях досліджують не тільки форму, розміри, загальні тинкторіальні властивості мікроорганізмів, айокреміелементиважливихструктур: нуклеоїд, цитоплазму, включення, клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану, капсулу, спори, джгутики тощо.

Нуклеоїд. У прокаріотів щенемаєморфологічно оформленого ядра, а є лише його попередник – нуклеоїд. Він представлений однією або кількома хромосомами, що складаються з ДНК і вільно розташовані в цитоплазмі, не відмежовані від

неї будь-якою мембраною. Морфологічно дослідити цю структуру під світловим мікроскопом дуже важко.

Розроблені спеціальні мікрохімічні реакції на виявлення ДНК. Однією з них є реакція Фельгена. Після легкого гідролізу мазка розчином соляної кислоти при підігріванні від дезоксірибофосфату відщеплюються пурини й піримідини, які переходять в альдегіди. Останні реагують з безбарвною фуксинсірчистою кислотою реактиву Шиффа, при цьому нуклеоїд забарвлюється в червоно-фіолетовий, а цитоплазма в світло-рожевий колір.

Ядерну субстанцію можна виявити за методом Пікарського. Фіксований метиловим спиртом або сумішшю Никифорова мазок обробляють 1 % розчином соляної кислоти, підігріваючи його до 60 °С протягом 7 хв. Після промивання його забарвлюють барвником Гімзи 10-20 хв, промивають дистильованою водою, висушують і мікроскопують. Ядерні елементи фарбуються в темно-червоний, а цитоплазма клітин – у рожевий колір.

Щекраще можнавиявитинуклеоїдідослідитийогоструктурузадопомогою електронної мікроскопії ультратонких зрізів бактерійних клітин.

Цитоплазма та її включення. Цитоплазмабактерій– складна колоїдна система. У молодих клітин вона гомогенна, у старих набуває зернистої або волокнистоїструктури. При забарвленні аніліновими барвниками цитоплазма фарбується рівномірно й монотонно.

Упроцесіжиттєдіяльностібактерійуцитоплазміз’являютьсяметахроматичні (волютинові) зерна, краплининейтральнихліпідів, воску, сірки, гранульози, глікоген, пігмент та ін. Вони є для клітини запасним джерелом енергії.

У лабораторній практиці найбільше значення має виявлення волютинових зерен. Волютиновимиїхназвалитому, щовпершецівключеннявідкритіуSpirillum volutans. Їх ще називають метахроматичними, оскільки вони дають явище метахромазії – здатність забарвлюватись у тон, що відрізняється від основного кольору поліхромного барвника. Наприклад, при фарбуванні метиленовим синім зерна набувають пурпурово-синього кольору через надзвичайно сильну спорідненість їх з азурами, які завжди присутні в метиленовому синьому барвнику. Поява пурпурового відтінку і обумовлена здатністю давати метахромазію. Ці включення називають також зернами Бабеша-Ернста за іменами авторів, які вперше описали їх. Розташовуються вони переважно на полюсах бактерій, рідше – по всій довжині клітини. Волютинові зерна є характерною диференціальною ознакою для збудника дифтерії – Corynebacterium diphtheriaе.

Для виявлення цих включень використовують методи Леффлера, Нейссера, П’ю, Мейера, Раскіної та ін.

Метод Леффлера. Фіксований мазок забарвлюють лужним спиртово-вод- ним розчином метиленового синього протягом 4-5 хв, висушують і мікроскопують. Прицьомуволютинові зерна забарвлюютьcявтемно-синій, ацитоплазма– в блідо-голубий колір (див. вкл., рис. 3).

МетодНейссераналежитьдоскладнихметодівзабарвлення. Вінпроводиться за таким алгоритмом:

1.На фіксований препарат наносять оцтово-кислу синьку Нейссера і фарбують протягом 1 хв, зливають барвник і промивають водою.

2.Діють на мазок розчином Люголя протягом 20-30 с.

3.Не промиваючи препарат водою, наносять розчин везувіну (або хризоїдину) і забарвлюють протягом 1-3 хв.

4.Забарвлений мазок промивають водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Мікроскопічнакартина: цитоплазмабактерійнихклітинфарбуєтьсявсвітлий жовто-коричневийвідтінок, метахроматичні зерна– втемно-синій, майжечорний колір (див. вкл., рис. 4).

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером

Барвник розчиняють у киплячій воді.

МетодП’ю. Готуютьспеціальнийбарвник: до2 млетанолудобавляють0,2 г толуїдиновогосинього, потім100 мл5 % розчинуоцтовоїкислоти. Барвникстійкий, зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і підігрівають до появи парів протягом 1-2 хв, охолоджують, промивають водою, висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення. Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну кислотостійкість. Самецявластивістьілежитьвосновіметоду. Здосліджуваного матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на полум’ї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв. Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % воднийрозчин сірчаної кислоти, другий– на такийже час у4 % розчинкалію карбонату. Обидвамазки, не промиваючи водою, висушуютьфільтрувальнимпапером. ПершийпрепаратпомічаютьлітероюК(кислота), другий– Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 % розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється у світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна – у вишнево-червоний. У мазку Л цитоплазма виглядає слабо забарвленою, а на місці метахроматичних зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову природу включень.

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину Циля– 4 мл, льодяної оцтової кислоти– 5 мл, етанолу 96° – 95 мл, дистильованої води– до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на полум’ї газового пальника до повного випаровування барвника, промивають водою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світлочервоний колір, а зерна волютину – в чорно-синій.

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки й капсули.

Цитоплазматична мембрана – м’яка, пластична, тришарова поліфункціональна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосомами, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

Клітинна стінка – своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає постійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних та осмотичних сил і виконує ряд інших важливих функцій, є унікальним структурним компонентом, властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно стінка складається з двох шарів: зовнішнього – пластичного і внутрішнього – ригідного, пружного.

Зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру, яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизовий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

Капсула – це міцно зв’язаний з клітинною стінкоюособливий слизовийшар. Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники сибірки, чуми, крупозної пневмонії), в інших – вона завжди є в усіх середовищах (клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лейконосток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виділяють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно зв’язані з клітинною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

Приповсякденнихдіагностичнихлабораторнихдослідженняхпотребавиявлятиклітиннустінкучицитоплазматичнумембранумайженевиникає. Підсвітловим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне зневоднення, цитоплазмаклітинзморщуєтьсяйвідстаєвідклітинноїстінки(плазмоліз). Під мікроскопом видно контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостерігається протилежне явище – плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка згодом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх контури (чохли).

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки. Найбільш відомими з них є методи Пєшкова, Гутштейна, Кнайзі.

Метод Пєшкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60 мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) протягом 15 хв, потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлюють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 с. Препарат висушують

наповітріймікроскопують. Оболонка виглядаєяктонкийчервонийобідокнавколо бактерійної клітини.

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутштейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв 10 % розчиномтаніну, промиваютьводоюірозглядаютьвнадавленійкраплі0,02 % водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлюються оболонки в фіолетовий колір вже через 5-10 с.

МетодКнайзі. Зафіксованийуполум’їпальникамазокпротравлюютьуспеціальномурозчині(насиченийводнийрозчинкалійнихгалунів– 70 мл, 20 % розчин таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, накривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка фарбується в червоний колір.

Забарвленнякапсул. Капсулибактеріймістять складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають гелеподібнуконсистенцію. Призвичайнихметодах фарбування вони погано сприймають барвники. Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і органів, мазках із гною, харкотиння вони виявляються при будь-якому методі фарбування у вигляді незабарвленихзон(ореолів) міжзабарвленимитіламибактерійісубстратом(рис. 13). Дляфарбування самих капсул запропоновані різні методи.

Спосіб Ребігера. Нефіксований мазок забарв- Рис. 13. Капсули бактерій. люють насиченим розчином генціановогофіолето-

вого у 40% формаліні протягом 15-20 с, швидко промивають водою і висушують. Капсули фарбуються у червоний, а бактерії – в темно-фіолетовий колір.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промивають водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним 1:3. Промиваютьводою, висушують, мікроскопуютьпідімерсійнимоб’єктивом. На темному димчасто-сірому фоні контрастно виділяються незабарвлені капсули, всередині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій (див. вкл., рис. 5).

МетодГісса. Тонкиймазокфіксуютьуспирт-формоліабосумішіНикифорова (аленежаром), фарбуютьрозчиномосновногофуксину(1 чнасиченогоспиртового розчинубарвника+ 19 чдистильованоїводи) зпідігріваннямдопоявипарів, потім залишають на 30 с для охолодження. Препарат промивають великою кількістю розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують. Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

МетодРомановського-Гімзи. Намазок, фіксованийметаноломабосумішшю Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують. Бактеріїзабарвлюютьсявсинійколір, капсули– ублідо-рожевий. Метод постійно дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул менш демонстративні.

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворювати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових культур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно заломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліновими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміриспорможутьнеперебільшуватидіаметрмікробноїклітини(Bacillus) або бути більшими за нього(Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової гангрени) або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують проникнення барвників.

МетодОжешки. Наприготовленийгустийнезафіксованиймазокспороносної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4 разидопоявипарів(протрава). Препаратпромиваютьводою, висушуютьфільтрувальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний (див. вкл., рис. 6).

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не вимагає хімічних протравідиференціювання вкислоті чи спирті. Йогопроводятьза таким алгоритмом:

1.Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового ріжка, або

вспиртовому формаліні.

2.На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до кипіння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 с.

3.Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином нейтрального червоного впродовж 30-40 с. Промивають дистильованою водою,

висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають синіми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний розчинхромовоїкислотина2-3 хв, промиваютьводою, висушуютьізабарвлюють за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору, а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають 5 % водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів, промивають струменем проточної води 30-40 с і додатково забарвлюють 0,5 % водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні органируху– джгутики, розміриякихдосягають0,02-0,04 мкмуширинуі6-80 мкм у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);