Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

312 Гл. 6. Лазерная спектрофотометрия и фурье-спектроскопия

фактором являются интерференционные эффекты в оптической схеме устройства, что, в основном, и определяет достигнутые значения (µa)min. Тщательная юстировка спектрометра, устранение обратных отражений и рассеянных потоков, а также использование корреляционных методик обработки полезного сигнала позволяют снизить этот порог.

Отметим, что в ряде случаев, например при использовании газов, возможно построение лазерных спектрометров для абсолютных измерений концентрации с относительной погрешностью в 1–3 % [1225, 1226]. Разработка абсолютных методов измерения необходима для анализа нестабильных газов или сверхмалых их количеств, когда нет возможности создания или хранения эталонов.

Существенно повысить чувствительность (в 102–105 раз) можно при использовании внутрирезонаторного поглощения, когда кювета с исследуемым веществом размещается внутри резонатора [293, 980, 982, 1223], поскольку автоматически реализуется большое число проходов (до нескольких сотен, если исследуемый объект не вносит значительных потерь) и измеряется не отношение I/I, а само значение I. Кроме того, в режимах генерации связанных волн (многомодовый двухзеркальный лазер или кольцевой лазер) эффекты конкуренции волн существенно повышают чувствительность лазеров к изменениям потерь внутри резонатора. Однако существуют факторы, несколько снижающие чувствительность метода (например, технические флуктуации лазера [982, 993]) или вообще не позволяющие его использовать (сильно поглощающие или сильно рассеивающие биообъекты). Внутрирезонаторный метод перспективен для регистрации очень слабых линий поглощения веществ, загрязняющих атмосферу, короткоживущих продуктов биохимических реакций, радикалов и нестабильных молекул [293]. Для создания высокочувствительных спектрометров, работающих на принципе измерения внутрирезонаторного поглощения, в большей степени подходят перестраиваемые лазеры с широкими линиями и значительным запасом по усилению. В видимой области — это лазеры на красителях, в ИК-области

— лазеры на центрах окраски [666] (см. главу 4).

Внутрирезонаторная спектроскопия с призмой полного внутреннего отражения внутри резонатора, когда внешняя часть трехзеркального резонатора образуется призмой полного внутреннего отражения (ПВО) с нанесенным на рабочую поверхность исследуемым материалом, может быть использована для высокоточных измерений показателя преломления жидких биологических сред, например образцов крови [1265]. Ряд схем внутрирезонаторной спектроскопии с ПВО-призмой, описан в работе [1266]. Метод был использован для исследований различий в показателе преломления образцов крови от здоровых и больных пациентов, а также при воздействии лазерного излучения терапевтических доз на кровь. Очевидно, что он может быть использован и для измерения комплексного показателя преломления, т. е. поглощения (см. выражение (1.2)).

Абсорбционно-трансмиссионный анализ весьма универсален и с успехом применяется при исследовании биологических сред в различных агрегатных состояниях. Газовый анализ, например, необходим при определении газообразных компонентов жизнедеятельности живых организмов, следовых концентраций загрязняющих веществ и пр. Для лазерного контроля загрязнений атмосферы разработаны многочисленные средства, многие из которых основаны на измерении поглощения [293, 982]. Контроль осуществляют путем отбора проб с последующим абсорбционным анализом в многоходовых кюветах пониженного давления. Проводят также трассовые измерения поглощения загрязняющих компонентов. Обычно загрязнители имеют характерные линии поглощения в ИК-области спектра, поэтому наиболее часто используются лазерные спектрометры на основе диодных и молекулярных лазеров, обеспечивающих необходимую перестройку в диапазоне длин волн 2,5–46,2 мкм.

Для диодных лазерных спектрометров порог обнаружения таких загрязнителей воздуха, как SO2, N2O, NH3 и NO2, находится в пределах от 1 ppb до 10 ppt (ppb = 10−7 %; ppt = 10−4 %), для HCl — около 0,1 ppm, для HF — около 0,5 ppm. Можно определять содержание HCN, H2O, CH4, C2H6 в сигаретном дыме, а также содержание токсических примесей в выхлопных газах автомобилей, например бензола, на уровне 1 ppm [293]. Диодная лазерная спектроскопия успешно применяется для анализа содержания СО, NO, 14NH3, 15NH3, C2H4, C2H4 в выдыхаемом человеком воздухе [1233, 1267, 1268]. Высокие чувствительность и быстродействие спектрометров позволили, например, изучить динамику газообмена в легких курильщика

испортсмена. С привлечением анализа содержания в выдыхаемом воздухе других

газов, например NH3, изотопов 12СО и 13СО, существует возможность контроля некоторых биохимических процессов в организме человека, а также диагностики ряда заболеваний — диабета, дисфункции кишечника, легких, печени и пр. В зависимости от регистрируемых газов требуемая чувствительность составляет 0,5–50 ppb

ибыстродействие — 0,1–5 с.

Применение непрерывно перестраиваемого ИК лазерного источника (2,7–4,5 мкм) на основе нелинейного смешения излучения лазера на красителе (550–660 нм) с излучением второй гармоники АИГ:Nd-лазера (532 нм) позволило регистрировать концентрации ацетона в воздухе, меньшие 50 мкг/л, при длине кюветы в 1 м [1234]. Увеличение длины кюветы до 10 м дает возможность регистрировать концентрации ацетона на уровне его содержания в выдыхаемом воздухе здорового человека (3 мкг/л), а также больных диабетом детей (20–370 мкг/л) и взрослых (3–50 мкг/л). Для СО2-лазера с дискретной перестройкой частоты измерения при атмосферном давлении методом дифференциального поглощения (зондирование атмосферы на двух длинах волн) дают порог обнаружения типичных органических молекул загрязнителей порядка 2,5 · 10−10–3,0 · 10−7 %/м [982].

Биологические объекты большей своей частью представляют конденсированные среды. Линии поглощения таких сред значительно уширены, поэтому высокая степень монохроматичности лазерного излучения не требуется. Однако лазеры и в этих случаях оказываются весьма полезными. Во-первых, узкая линия их излучения позволяет отстраиваться от центра линии поглощения сред с высокой оптической плотностью и тем самым обеспечивать линейную зависимость поглощения от концентрации. Во-вторых, высокая спектральная яркость лазеров позволяет проводить измерения поглощения в оптически плотных образцах. Например, для инжекционных

лазеров Dmax ≡ (µad)min ≈ 12 [293].

Содержание кислорода, углекислого газа, окиси углерода, воды и других веществ (включая различные продукты метаболизма: мочевину, глюкозу, ацетон и пр.), растворенных в крови человека, является важнейшей информацией о жизненно важных процессах, происходящих в организме [34]. Измерение степени насыщения крови кислородом основано на значительных изменениях в спектрах поглощения насыщенной и ненасыщенной кислородом крови. Например, потеря гемоглобином крови кислорода приводит к шестикратному увеличению коэффициента поглощения цельной крови на ИК-линии с λ = 960 нм (см. табл. 3.1). Это дает возможность определять содержание кислорода в крови при использовании ИК-полупроводниковых лазеров или светодиодов, излучение которых глубоко проникает в биоткань. Для повышения точности, а также обеспечения абсолютных измерений концентрации гемоглобина и оксигемоглобина используют измерение диффузного отражения на нескольких длинах волн в видимой и ближней ИК-области спектра, включая изобестическую длину волны с λ = 805 нм, для которой коэффициенты поглощения насыщенной и ненасыщенной кислородом крови совпадают (см. табл. 3.1).

Можно измерять коэффициент пропускания тонкого слоя ткани в области между большим и указательным пальцем человека, в ушной раковине и т. д., либо использовать призму полного внутреннего отражения в виде пластины с несколькими отражениями, по которой пропускается свет и которая прикладывается к исследуемому объекту (кожа, язык и пр.). Отражательные методики являются более универсальными и, как правило, используют волоконно-оптические пробники для сопряжения с измерительным блоком, в частности, при исследовании внутренних органов применяют волоконно-оптические зонды [80].

Оптическая неоднородность биологических сред в значительной мере усложняет или даже делает невозможным измерение спектров пропускания, вызывает необходимость переходить к другим способам измерения спектров поглощения. При наличии рассеяния коэффициент µa(λ) из (6.1), (6.2) имеет уже смысл коэффициента ослабления и определяется концентрацией не только поглотителей, но и рассеивателей на пути лазерного пучка. Выражения (6.1) и (6.2) сохраняют свою форму при σa = σt. Эффективное сечение ослабления учитывает как поглощение, так и рассеяние:

Коэффициенты Qa и Qs в общем случае определяются на основании теории Ми. Для малых частиц (a 1, |m|2πa/λ 1, m — комплексный показатель преломления частицы) в приближении Рэлея

Максимальное значение Qa и Qs достигается при a λ и составляет примерно 1–5, что следует из теории Ми. При наличии многих компонентов, поглощающих и рассеивающих свет, что также характерно для биосистем, (6.2) имеет вид

X

где σti = σai + σsi; Ni — плотность частиц i-го компонента.

Очевидно, в таких условиях в рамках спектрофотометрической методики поглощение не может уже быть определено без привлечения характеристик рассеяния, рассмотренных в главах 1 и 2. Для сравнительно прозрачных сред используют комбинированные методики, в основе которых лежит измерение спектров диффузного отражения биообъектов и спектров пропускания. Например, при исследованиях параметров крови (определении процентного содержания кислорода в цельной крови, концентрации общего (тотального) гемоглобина крови, концентрации метагемоглобинов) представляет большой интерес метод, использующий измерение диффузного коэффициента отражения Rd и относительного пропускания слоев крови разной толщины τ12 [1235, 1236]. В этом случае показатель поглощения единичной толщины

При исследовании толстых тканей (например, молочной железы) в условиях многократного рассеяния коллимированное пропускание может быть описано на основании достаточно простых соображений, учитывающих, что за счет многократного рассеяния эффективный путь фотона в среде до его поглощения будет больше, чем толщина ткани. А именно, согласно [491]], для плоского слоя толщиной d в диффузионном приближении средняя длина пробега фотона

где µd определяется соотношением (2.7). С учетом (6.1) и (1.1) при согласовании показателей преломления на границах (n = 1) коллимированное пропускание может быть записано в виде [506]

где L(λ) отражает зависимости µa(λ) и µ′s(λ); x1 и x2 — не зависящие от длины волны подгоночные параметры, необходимые для согласования с абсолютными значениями спектральных составляющих измеренных спектров пропускания, x1 учитывает геометрию эксперимента и потери рассеянных фотонов, которые не попадают на фотодетектор, x2 компенсирует неточности в определении толщины ткани и редуцированного коэффициента рассеяния µ′s.

Полуэмпирическое соотношение (6.17) успешно использовалось для восстановления спектров поглощения тканей молочной железы из измерений спектров коллимированного пропускания in vivo и определения концентрации отдельных поглотителей в тканях: воды (H2O), жира (f ), гемоглобина (Hb) и оксигемоглобина (HbO) [506]:

где σi — сечение поглощения i-го компонента.

При варьировании концентрации отдельных компонентов измеренные спектры пропускания хорошо описывались с помощью соотношения (6.17), коэффициенты корреляции всегда были больше 0,99. На рис. 6.3 показан спектрометр для измерений спектров коллимированного пропускания молочной железы in vivo, а также примеры измеренных спектров для нормальной и патологической ткани (раковая опухоль) и соответствующие восстановленные спектры поглощения для определенного набора концентраций четырех компонентов ткани (см. (6.18)). Наибольшие различия в спектрах имеют место в области 900–1000 нм, что в основном связано с различиями в содержании жира и воды в нормальной и патологической ткани, однако регистрируемые отличия между доброкачественными и злокачественными изменениями ткани (мастопатия и карцинома) не так заметны, поэтому требуется дальнейшее развитие методики.

Значительные успехи имеет спектрофотометрия ближнего ИК при исследовании степени оксигенации тканей мозга новорожденных и плода [88]. Достаточная прозрачность для ИК-света тканей головы новорожденного и ее небольшие размеры, а также доступность спектрометров с охлаждаемыми матричными детекторами позволили создать спектральные системы визуализации участков тканей мозга с различной степенью оксигенации. В последние годы круг решаемых задач в области спектроскопии ближнего ИК биотканей существенно расширился, в основном за счет применения методик с временным и пространственным разрешением, а также совершенствования фотоприемных устройств [12, 13, 41, 88]. В мире насчитывается уже более 500 коммерческих клинических приборов разной степени сложности для

Рис. 6.3. Спектрометр для измерений спектров пропускания молочной железы in vivo [506] (а): 1 — вольфрамовая лампа, 2 — монохроматор с λ = 550–1050 нм, 3 — волоконный кабель, 4 — прозрачная пластина, 5 — кремниевый фотодиод, 6 — усилитель с фазовым детектором, 7 — компьютер; спектры пропускания молочной железы (б): 1 — в области карциномы, 2 — в аналогичной по расположению области, но на другой здоровой молочной железе

мониторинга степени оксигенации, содержания цитохром оксидазы и гемодинамики биотканей. Некоторые из них представлены в табл. 2.3 и 2.4.

Для многих биотканей измерения in vivo оказываются возможными только в режиме отражения. Соответствующее соотношение может быть записано на основе диффузионного приближения. Для полубесконечной среды, близкой к коллимированному освещению и приему отраженного света при малой площади источника и приемника (пара световодов — источник и приемник), диффузионное уравнение (2.6) решается в замкнутой форме [1232, 1244]:

где z0 = K/µ′s — эффективная длина; K — безразмерная константа, величина которой зависит от коэффициента отражения на поверхности; A — площадь детектора; µd — определяется соотношением (2.7); ρ — расстояние между источником и приемником.

Типичный спектрометр отражения для измерений in vivo и соответствующие спектры для нормальной и патологической ткани показаны на рис. 6.4 [80]. Различные участки спектра определяются поглощением различных хромофоров ткани. Область 400–440 нм соответствует полосе Соре гемоглобина, однако определенный вклад дают флавины, бета каротин, билирубин, цитохром и др., в то время как область 540–580 нм соответствует Q-полосе гемоглобина с малым вкладом в суммарное поглощение цитохрома и других компонентов. На различиях во вкладах поглотителей в отдельные полосы и основана диагностика различных патологических изменений ткани. Методики диагностики in vivo используют либо соотношение интегральных коэффициентов отражения по выделенным полосам, либо измерение наклона спектральных кривых по отдельным участкам спектра (производная спектроскопия) [80, 1232].

Рис. 6.4. Cпектрометр для измерений in vivo спектров отражения внутренних органов [80] (а): 1 — ксеноновая дуговая лампа, 2 — стандартный отражатель, 3 — встроенные в компьютер спектральные чипы, 4 — линейки фотодетекторов, 5 — волоконно-оптический пробник, 6 — биоткань, 7 — компьютер. Спектры отражения (б): 1 — нормальная слизистая, 2 — частично злокачественная аденома, измерения в прямой кишке у больного простатитом

Для некоторых многослойных биотканей, например кожи, кинетика спектров отражения при изменении поглощения в отдельных слоях может быть рассмотрена

Измерение отражения кожи тела или губ в ближней ИК-области позволяет определять содержание глюкозы в ткани [34, 564–566, 1242, 1243, 1248, 1249]. Для метода с использованием волн фотонной плотности (частота возбуждения 120 МГц, см. раздел 2.3) при измерениях in vivo на длине волны 850 нм диапазон измеряемых концентраций равен 0,8–1,5 мг/мл с ошибкой ±0,025 мг/мл (соответствующие изменения приведенного коэффициента рассеяния µ′s составляют примерно 0,6 %/мМ). Для отражательной спектрофотометрии in vivo с пространственным разрешением (см. (6.19)) на λ = 650 нм чувствительность по µ′s составляет 0,11 %/мМ [565], что пока ниже требуемой для клинических применений (современные инвазивные методы дают точность 0,5 мМ при измерении концентрации на уровне 5 мМ).

Представленные спектрофотометрические методики для клинических исследований требуют зачастую не только относительных измерений спектров отражения, но и достаточно точного определения абсолютных значений концентрации тех или иных хромофоров (гемоглобина, оксигемоглобина, глюкозы и пр.) по этим спектрам. Для абсолютных измерений используют внутренний спектральный эталон — спектр поглощения воды [1241]. Для многих биотканей в норме и в различных патологических состояниях достаточно хорошо известно содержание воды (с точностью до нескольких процентов), при этом в ближней ИК-области спектра на ряде линий поглощение определяется практически только поглощением воды (см. рис. 1.12), поэтому возможна достаточно точная калибровка измеряемых спектров и соответственно абсолютное определение концентрации интересующего хромофора. Сочетание такой калибровки с техникой двукратного дифференцирования спектров и процедурой многолинейной регрессии при согласовании дифференциальных спектров воды и гемоглобина позволяет получать абсолютные значения гемоглобина в двух его формах и суммарное кровенаполнение мозговой ткани с ошибкой порядка 10 % [1241].

Многоволновый метод одновременного определения абсолютных концентраций гемоглобина и воды в коже на основе отражательной спектрофотометрии с пространственным разрешением (см. (6.19)) описан в [1245]. Определены две группы спектральных линий для оптимального определения содержания воды (1060, 1160, 1200 и 1320 нм) и гемоглобина (1040, 1120, 1140 и 1200 нм) в типичных экспериментальных условиях.

Измерение коэффициентов отражения биотканей в процессе их коагуляции необходимо для контроля термохимических процессов в очаге коагуляции, определяющих конечный результат воздействия [2, 202, 240, 1229, 1237, 1238]. Такой контроль, в частности, применяют в офтальмологии при коагуляции тканей глазного дна [240, 1237, 1238]. Обнаружено, например, сильное увеличение отражения излучения на λ = 441,6 нм от тканей глазного дна при коагуляции сетчатки излучением аргонового лазера (λ = 514,5 нм) [1237].

Специально для медицинских применений разработаны лазерные биофотометры, предназначенные для определения интенсивности отраженного, поглощенного и прошедшего излучения биотканями поверхностных и внутренних органов [1239].

Выпускаются компактные рефлектометры на основе светодиодов для объективного контроля изменений в коже (эритемометры и меланинометры, оксиметры и пр.), вызванных, например, воздействием УФ-излучения или любого другого внешнего воздействия, например теплового или механического, а также для контроля изменения метаболического или патологического характера (воспалительные и опухолевые процессы) [41, 902, 971, 1180]. С использованием измеренных коэффициентов отражения на характерных длинах волн в видимой области (560–570 нм, 635–650 нм, 695–710 нм), соответствующих спектрам поглощения гемоглобина и меланина, определяются степень покраснения (эритема) и степень пигментации кожи, что служит критериями дозировки при лазерной или фототерапии, а также позволяет