Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

Следуя методике, изложенной в работе [332], назовем главные преимущества и недостатки КР и РКР, имея в виду биомедицинские исследования.

Преимущества.

1.Спектроскопия КР может быть использована применительно к водным растворам и биотканям, так как интенсивность спектра КР воды невелика и он лишь незначительно мешает наблюдению спектра растворенного вещества. В то же время вода очень сильно поглощает ИК-излучение, что затрудняет изучение ИК абсорбционных спектров водных растворов и различных биологических тканей, содержащих значительное количество воды.

2.Спектроскопия КР в равной степени пригодна для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, тканей, твердых веществ и монокристаллов.

3.Для исследования необходимы небольшие количества вещества, объем КР-мик- ропробы определяется поперечными размерами сфокусированного лазерного пучка.

4.Благодаря использованию лазеров, КР-спектроскопия легко реализуется для различных объектов медицинских исследований с помощью традиционного спектрального оборудования.

5.Ковалентным связям между одинаковыми атомами, такими как С–С или S–S,

вспектрах КР соответствуют линии высокой или средней интенсивности. Полосы же в ИК-спектрах поглощения для данных связей имеют низкую интенсивность или вообще не проявляются.

6.С помощью обычного спектрометра КР за одно сканирование можно получить весь колебательный спектр от 10 до 4000 см−1, что в ИК-абсорбционной спектроскопии сделать непросто.

7.Временную шкалу КР и РКР можно считать мгновенной. Спектр КР исследуемой системы, в которой происходит быстрый химический обмен, представляет собой наложение спектров всех участвующих в обмене частиц, причем интенсивность спектров прямо пропорциональна концентрации частиц.

8.С использованием ОМА спектр КР можно снять менее чем за 1 с.

9.Увеличение интенсивности вследствие эффекта РКР обеспечивает селективность спектральной регистрации и позволяет получать колебательный спектр хромофора, который является одним из компонентов сложной биологической смеси.

10.Интенсивность в спектрах РКР дает информацию и о возбужденных электронных состояниях. В этом заключается специфическое достоинство метода, поскольку многие важные для биологии молекулы, например хлорофилл и родопсин, реагируют

ввозбужденных состояниях.

Недостатки.

1.Высокая плотность лазерного излучения может вызвать нежелательные фотохимические и деструктивные эффекты.

2.КР и даже РКР относятся к числу фотопроцессов, имеющих малое поперечное сечение взаимодействия, поэтому регистрация спектров КР затруднена из-за влияния конкурирующих процессов, например флуоресценции.

3.Обычно для регистрации спектров КР необходимы концентрации веществ, которые в биохимии считаются достаточно высокими (10−1–10−2 моль/л для КР

и10−4–10−6 моль/л для РКР).

4.При регистрации спектров КР-растворов обычно необходима высокая оптическая однородность жидкости. Данные требования менее строги в случае РКР.

При исследовании биообъектов с высоким уровнем флуоресценции можно воспользоваться технически более сложным, но существенно более селективным и имеющим высокое спектральное разрешение методом активной спектроскопии КР

394 Гл. 8. Лазерный микроспектральный анализ в биомедицинских исследованиях

(АСКР) [5]. Этот метод основан на использовании двух перестраиваемых лазеров с частотами ω1 и ω2, пучки которых, пересекаясь в исследуемом образце, вызывают когерентное антистоксово рассеяние на частоте ωa = 2ω1 − ω2, интенсивность которого существенно возрастает при совпадении разностной частоты, ω1 − ω2, с частотой исследуемого внутримолекулярного колебания. Помимо высокого спектрального разрешения, метод дает значительную интенсивность рассеянного поля и его направленность.

Возможны и более сложные варианты АСКР, применяемые, например, для исследования возбужденных электронных состояний с пикосекундным временным разрешением. В данном случае исследуемые молекулы возбуждаются излучением пикосекундного лазера накачки, а АСКР-проба осуществляется тремя лазерными пучками с фиксированной частотой ω и перестраиваемыми частотами ω1 и ω2. При этом наряду с когерентным антистоксовым рассеянием (ωa = 2ω − ω2) регистрируется

и когерентное стоксово (ωc = 2ω2 − ω) 1).

При изучении веществ низкой концентрации эффективным является так называемый метод гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) 2), который заключается в существенном (до 105–106 раз) увеличении сечения КР молекул, адсорбированных на поверхности металла с сильной шероховатостью [5, 344, 1374, 1375].

Увеличение сечения рассеяния позволяет избежать проблемы сильного влияния флуоресценции при возбуждении ГКР в видимой области. Например, согласно [342], сильно флуоресцирующие желтые пигменты в хрусталиках человека и ряда животных не дают возможности зарегистрировать КР- и РКР-спектры, однако спектры ГКР на золях серебра довольно легко регистрируются в полосе 150–1800 см−1 при возбуждении Аr-лазером с λ = 514 нм мощностью 20 мВт.

Буквально революционные изменения происходят в настоящее время в КР-спект- роскопии биологических объектов в связи с новыми возможностями возбуждения КР-спектров в ИК-области спектра, что, в частности, связано с разработкой высокочувствительных и быстродействующих ИК-фурье-спектрометров (см. главу 6) [63]. С точки зрения исследований биологических тканей, достоинства ИК КР-фу- рье-спектроскопии сводятся к следующему.

1.Отсутствует проблема устранения влияния флуоресценции, так как при ИК-возбуждении флуоресценция, как правило, не возбуждается, что дает возможность исследовать новый класс сильно флуоресцирующих при возбуждении видимым светом компонентов биотканей.

2.Упрощается интерпретация спектров КР, поскольку возбуждение далеко от резонансного.

3.Появляется возможность одновременно регистрировать стоксовы и антистоксовы компоненты КР-спектра, что позволяет надежно определять колебательную температуру в рассеивающем объеме образца.

4.Вплоть до наименьших КР-сдвигов частоты (порядка 40 см−1) ИК- КР-фу- рье-спектры имеют более тонкую структуру, чем аналогичные абсорбционные ИК-фу- рье-спектры.

5.Высокая прозрачность большинства биообъектов в ближней ИК- и их непрозрачность в УФ- и видимой областях спектра (см. главы 1 и 2) позволяют легко

1) В современной литературе используются следующие названия: CARS — Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (когерентное антистоксово рамановское рассеяние) и CSRS — Coherent Stokes Raman Scattering (когерентное стоксово рамановское рассеяние).

2) В зарубежной литературе такой метод называется SERS — Surface-Enhanced Raman Scattering.

скомпенсировать потери в сигнале (по сравнению с возбуждением в УФ- и видимой областях), возникающие за счет увеличения длины волны возбуждения (λ−4), и дают возможность исследовать ткани без предварительной подготовки in vitro и in vivo.

6.Отсутствует необходимость тщательного перемешивания или вращения объектов исследования, так как нет опасности пиролиза цветных образцов.

7.Идеальными источниками для возбуждения КР-спектров являются АИГ:Nd-ла- зер с λ = 1060 нм, а также перестраиваемые в ближней ИК-области спектра лазеры на ЩГК и ионных кристаллах, сравнительно недорогие полупроводниковые лазеры претендуют стать источниками возбуждения для клинических КР-спектрометров (см. главу 4).

Технически ИК КР-фурье-микропроба реализуется следующим образом: рассеянное биообъектом излучение поступает на вход фурье-спектрометра и далее регистрируется с помощью ИК-детектора, подключенного к внешнему выходу спектрометра (см. рис. 6.8). Возбуждение рассеянного сигнала можно осуществить, например, по схеме, показанной на рис. 8.14.

Высокую чувствительность и пространственную разрешающую способность КРспектроскопии удается обеспечить и в рамках обычного КР при возбуждении в ви-

димой области. Например, в [333] описан высокочувствительный КР-конфокальный микроскоп с объемом микропробы порядка 0,2 мкм3 (λ = 660 нм) для исследования отдельных клеток и хромосом. В микроскопе излучение флуоресценции и КР от соседних (не исследуемых) участков объекта устраняется с помощью конфокальной конфигурации приемной оптической системы (точечная диафрагма диаметром около

100 мкм в области фокуса регистрируемого светового потока от объекта). Кроме того, для подавления упруго рассеянного излучения (в 108 раз) и излучения флуоресценции используются узкополосный интерференционный фильтр специальной конструкции и отрезающий фильтр на основе цветного стекла. Применение фильтров

допускает снятие КР-спектров в диапазоне частот 600–3000 см−1. В качестве ОМА на выходе полихроматора используется охлаждаемая жидким азотом твердотельная ПЗС-камера. Спектрометр существует в двух модификациях: с λ = 660 нм и λ = 514 нм.

Изготовление спектрометра строго на одну из длин волн позволяет обеспечить эффективное подавление рэлеевского рассеяния и флуоресценции. Получены, например, КР-спектры цитоплазмы и ядра отдельного нейтрофильного гранулоцита, отдельного ядра лимфоцита человека, а также отдельной хромосомы в диапазоне частот 600–1700 см−1 за время от 30 до 600 с при мощности лазера (λ = 514 нм) от 10 мВт до 1 мВт. Более длинноволновое возбуждение позволяет исследовать более широкий спектр клеточных элементов без их повреждения. Например, жизнеспособность клеток оставалась неизменной даже при облучении в течение 300 с на длине волны 660 нм при мощности 20 мВт и размере пучка лазера около 0,25 мкм2 (плотность мощности 8 МВт/см2), однако при исследовании цитоплазмы гранулоцитов было необходимо несколько снижать мощность излучения (до 6 мВт) и время измерения (до 30 с) [333].

Влияние флуоресценции существенно зависит от типа исследуемых клеток и изучаемой органеллы клетки. При исследованиях лейкоцитов на λ = 660 нм флуоресценция не наблюдалась вовсе, а ее уровень при возбуждении на λ = 514 нм не создавал трудностей при измерениях [333].

Обзор исследований бактерий и клеток животных и человека с использованием КР-микроскопии с возбуждением в УФ- и видимом диапазонах длин волн представлен в работе [333]. Достаточно детально изучены клетки крови человека: тромбоциты, эритроциты и многие типы лейкоцитов и их компоненты. КР-микроскопия дала много новой информации о функционировании этих клеток и их изменениях при

396 Гл. 8. Лазерный микроспектральный анализ в биомедицинских исследованиях

различных патологиях. Исследовались также процессы и содержание компонентов внутри фоторецепторных клеток, клеток спермы, раковых клеток [333]. Таким образом, КР-спектроскопия отдельных клеток перспективна для изучения субклеточных структур и их функциональных особенностей, а также для контроля метаболизма клеток в нормальных и патологических состояниях и их отклика на лекарственные препараты.

Спектроскопия КР как неинвазивный метод лазерной диагностики, дающий информацию об объекте на молекулярном уровне и имеющий значительные перспективы для проведения анализа in vivo и in situ, все больше проникает в область медицинских исследований. Первым и остающимся одним из основных применений КР-спектроскопии в медицине является офтальмология (изучение интактных хрусталиков животных и человека [63, 340, 341, 346, 347]). Разработка КР-микро- спектрометров с многоканальной регистрацией спектров, обеспечивающих высокое быстродействие и пространственное разрешение (локальность) при значительной чувствительности, открывает возможность проведения ранней диагностики такого серьезного и массового заболевания, как катаракта. Блок-схема одного из спектрометров представлена на рис. 8.17. Главным элементом спектрометра является высокочувствительный охлаждаемый многоканальный детектор, который в сочетании с Аr-лазером (λ = 488 нм) небольшой мощности (2–30 мВт) позволяет получать КР-спектры в довольно широкой полосе частот за очень малое время (рис. 8.18) и определяет возможность снятия КР-спектров in vivo. Заметим, что при мощности излучения лазера 2 мВт и выше происходят повреждения ретинальной оболочки глаза при времени облучения 0,5 с.

Рис. 8.17. КР-спектрометр для измерений in vivo [1374]: 1 — лазер на красителях; 2 — эксимерный лазер; 3 — непрерывный Аr-лазер; 4 — образец; 5 — дифракционный спектрограф; 6 — синхронный импульсный генератор; 7 — охлаждаемый многоканальный детектор; 8 — графопостроитель; 9 — компьютер; 10 — дисплей; 11 — магнитная память. Пунктиром показана часть установки для импульсной КР-диагностики

Импульсный вариант КР-спектрометра на основе перестраиваемого лазера на красителях, накачиваемого эксимерным или азотным лазером, позволяет с большей гарантией реализовать измерения in vivo за счет оптимизации возбуждения спектров (подстройка частоты лазера) и уменьшения экспозиции (импульсный режим) (см. рис. 8.17, показано пунктиром).

Рис. 8.18. КР-спектры хрусталика глаза кролика в области ядра при возбуждении Аr-лазером с λ = 488 нм [340]: 1 — измерения in vivo, мощность излучения лазера P = 2 мВт, 2 — измерения для изолированного хрусталика (P = 30 мВт). Время экспозиции для каждого из трех фрагментов спектра порядка 0,5 с

КР-микроспектрометр, работающий на линии 514 нм аргонового лазера с мощностью 60 мВт и диаметром пятна на объекте в 2 мкм, использовался для снятия спектров хрусталика в диапазонах частот 200–1400, 700–1900, 2400–3600

и2800–4000 см−1 с помощью дифракционного спектрометра и многоканального анализатора с линейкой из 1024 фотодиодов [1374]. Время измерения полного спектра составляло 5–30 мин. Данные по КР-сдвигам частоты характерных полос в спектре

ирезультаты их отнесения представлены в табл. 8.2.

КР-спектр нормального хрусталика образуется перекрывающимися спектрами так называемых α-, β- и γ-кристаллинов — структурных белков (вес которых у млекопитающих составляет приблизительно 33 % от общего веса хрусталика), спектрами их производных (в основном агрегатов белков) и воды, содержащейся в хрусталике [341]. С помощью КР-спектроскопии изучается молекулярная структура нормальных, состарившихся и катарактальных хрусталиков животных и человека, в том числе и хрусталиков, подвергнутых воздействию УФ-излучения и воздействию лекарственных препаратов [63, 341, 1374]. Наиболее интересные результаты получены для вторичной структуры белков хрусталика и для микроокружения боковых групп белков (триптофана, тирозина и сульфидных групп). Для ранней диагностики катаракты представляют интерес следующие полосы [340, 1374]: широкая полоса в диапазоне частот 3600–3100 см−1, определяемая наличием воды в хрусталике; полоса с ча-

398 Гл. 8. Лазерный микроспектральный анализ в биомедицинских исследованиях

Т а б л и ц а 8.2. Характерные полосы спектра КР свежеприготовленного целого хрусталика глаза кролика, полученного от поверхностного слоя над ядром хрусталика (Гисберс и др. [1374])

Примечание. Время измерения 5 мин. Хрусталик погружен в иммерсионную жидкость. Источник возбуждения — Ar-лазер с λ = 514,5 нм, мощность 60 мВт, размер пятна на объекте — 2 мкм. Значения КР сдвигов частоты приведены без учета нелинейности шкалы длин волн спектрографа. Ф — фенилаланин, ТРФ — триптофан, ТРЗ — тирозин; (*) — неароматический фрагмент, (**) — ароматический фрагмент.

стотой 2580 см−1 (νe = 2568 см−1, по данным табл. 8.2), отнесенная к валентным колебаниям сульфидных групп цистеинового остатка; дублетные полосы тирозина на частотах 855 и 831 см−1 (νe = 829 см−1, см. табл. 8.2); полосы триптофана на частотах 880 и 760 см−1; конформационные полосы полипептидного основания на νe = 1672 см−1 амида I и νe = 1240 см−1 амида III; полосы триптофана на νe = 644 см−1 и фенилаланина на νe = 624 см−1 (νe = 622 см−1, см. табл. 8.2).

Отношения интенсивностей наиболее характерных КР-полос хрусталика глаза кролика, чувствительных к искусственно вызванной за счет соответствующей диеты катаракте, представлены в табл. 8.3 [1374]. Изменения в полосах, соответствующих воде, сульфидным группам, тирозину, триптофану и фенилаланину, а также амиду I и амиду III, предполагают ряд структурных модификаций, возникающих при формировании катаракты, которые приводят к частичному преобразованию триптофановых остатков белков хрусталика из «закрытой» в «открытую» форму, возможности вовлечения тирозиновых остатков в предполагаемый процесс «агрегации белков», одновременному частичному превращению SН-групп цистеина в S–S связи [1374].

та вызвана искусственно за счет диеты; лекарственный препарат — Bendalina) (Бертолуцце и др. [1374])

Отношение интенсивности полосы 3390 см−1 (ОН-валентные колебания) к интенсивности полосы 2935 см−1 (СН-валентные колебания) изменяется от 0,40 для прозрачного хрусталика до 0,50 для катарактального хрусталика глаза кролика (см. табл. 8.3). При обработке хрусталика антикатарактальным лекарственным препаратом это соотношение устанавливается на уровне 0,43 [1374]. Обратные процессы происходят в ядре хрусталика мыши при старении, когда данное отношение уменьшается от 0,33 до 0,18 [341]. Такие изменения свидетельствуют о потере воды в процессе старения. В то же время исследования трех типов катаракты у мышей показывают, что интенсивность ОН-валентных колебаний (3390 см−1) существенно возрастает по мере помутнения хрусталика. Например, отношение интенсивностей для катарактального и нормального хрусталиков при одинаковом возрасте, равном 4 месяцам, составляет 1,1–1,4. Таким образом, относительная интенсивность характеристических колебаний Н2О может служить в качестве теста при диагностике катаракты. Однако следует помнить об адекватности моделей старения хрусталиков разных типов экспериментальных животных модели старения хрусталика человека [63].

При исследовании структурных изменений катарактальных хрусталиков человека возникают определенные трудности из-за их сильной флуоресценции, которая усиливается с возрастом. Отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности отдельных полос в КР-спектре является мерой патологии хрусталика, что связано с его помутнением за счет высокомолекулярных агрегатов белков, которые одновременно являются и новыми либо видоизмененными флуорофорами [341]. Воздействие антикатарактальных препаратов значительно снижает фон флуоресценции в КР-спектрах, данный эффект может служить мерой действия препаратов. С другой стороны, удлинение длины волны возбуждающего лазера от 407 нм до 514 нм и далее до 647 нм позволяет сильно уменьшить фон флуоресценции и надежно регистрировать КР-спектры [63, 1374].

Как уже отмечалось выше, КР-тест на наличие катаракты определяется содержанием воды в хрусталике, что количественно может быть охарактеризовано как отношение интенсивностей КР-полос воды (3390 см−1) и белка (2935 см−1). В выявлении природы изменения баланса воды важное значение имеет регистрация распределения ее содержания по хрусталику. Например, с использованием конфокального КР-микроскопа (см. рис. 8.15) и сканирования возбуждающего лазерного пучка удается контролировать содержание воды в хрусталиках животных и человека с пространственным разрешением не хуже 0,1 мм или изучать водный обмен in vitro [347]. В последнем случае использовалась методика замещения воды в хру-

400 Гл. 8. Лазерный микроспектральный анализ в биомедицинских исследованиях

сталике на тяжелую воду, а в качестве индикаторов замещения воды в ткани на тяжелую воду служили валентные колебания OD (2450 см−1) и OH (3390 см−1), при этом валентное колебание CH белков хрусталика (2935 см−1) использовалось как внутренний стандарт. По отношению интенсивностей линий КР I2450/I2935

иI3390/I2935 определяли временную зависимость относительной концентрации D2O

иH2O. На основании этих измерений были найдены значения скорости диффузии воды в интактном и фиксированном хрусталиках, которые оказались соответственно равными 3 · 10−6 см2/c и 0,75 · 10−6 см2/с. Уменьшение коэффициента диффузии после фиксации может объясняться формированием дополнительных связей между молекулами белков хрусталика, которые препятствуют транспорту воды.

Для контроля процессов метаболизма хрусталиков животных и человека с целью разработки эффективной методики диагностики катаракты был создан автоматизированный спектральный комплекс лазерной флуоресцентной/КР-микропробы (рис. 8.19) [342]. В данном случае сопровождающий флуоресценцию КР-сигнал является нормирующим. Если излучение возбуждения достаточно длинноволновое, то отношение интенсивностей флуоресценции (Iфл) и КР (Iкр) может быть использовано

в качестве возрастного критерия качества хрусталика (ухудшение качества с возрастом). В частности, для каждого хрусталика существует своя критическая длина волны возбуждения λкр, ниже которой КР-спектр наблюдается без флуоресцентной подставки.

Рис. 8.19. Автоматизированная сканирующая система для лазерной КР/флуоресцентной микропробы [342]: 1 — Не–Сd-лазер (λ = 441,6 нм), Аr-лазер (λ = 488,0; 514,5 нм) или Кr-лазер (λ = 406,7; 647,1 нм); 2 — фильтр для устранения линий плазмы газового разряда лазера; 3 — электронноуправляемый затвор; 4 — пространственный фильтр; 5 — монитор; 6 — видеокамера; 7 — поворотная призма; 8 — делитель пучка; 9 — объектив микроскопа; 10 — объект; 11 — охлаждаемая пластина; 12 — управляемый по осям x и y столик; 13 — трехрешетчатый монохроматор; 14 — 700-канальный оптический анализатор (РА 1420); 15 —

контроллер анализатора; 16 — компьютер; 17 — интерфейс

Спектральный комплекс (см. рис. 8.19) имеет следующие важные достоинства: 1) многоканальную регистрацию для различных точек биообъекта с шагом 1–8 мкм; 2) два типа сканирования образца — микро (10 · 10 мкм) и макро (2,5 × 2,5 см); 3) автоматическую одновременную регистрацию интенсивности флу-