Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

Рис. 7.9. Конструкции спектрофонов, используемых при исследовании газообразных веществ [5, 329]: 1 — пучок света; 2 — микрофон; 3 — окошко; 4 — газ; 5 — фторопластовая диафрагма

и ячейки, как правило, не должно превышать 0,2. Многократное пропускание света через ячейку эквивалентно увеличению мощности или энергии падающего излучения, поэтому приводит к усилению акустического сигнала. Поскольку реальная чувствительность спектрофона определяется уровнем фоновых сигналов, то конструирование ОА-ячеек идет по пути максимального снижения их влияния на полезный сигнал. Один из возможных путей снижения — сравнение сигналов от двух идентичных ячеек, заполненных газом с близкими термодинамическими параметрами и освещаемых одинаковыми пучками света. Возможно как параллельное, так и последовательное расположение ячеек. В общем случае при равных объемах обеих камер их длина и, соответственно, диаметры могут быть различными, так как согласно (7.10) и (7.15) полезные сигналы от таких камер сильно различаются по амплитуде, а фоновые сигналы остаются одинаковыми и «вычитаются» на дифференциальном микрофоне.

Хорошие результаты можно получить, существенно уменьшая объем ячейки, при условии, что ее эффективное поперечное сечение также уменьшается, т. е. отношение длины ячейки к наименьшему из поперечных размеров составляет 6–10. Проблема уменьшения объема исследуемого вещества связана, в частности, с возможностью определения минимального количества примеси в газах, а в случае жидкостей или порошков — с проблемой изучения состава редких и дорогостоящих веществ (например, вновь синтезированных в малых количествах лекарственных препаратов). ОА-метод в настоящее время, по-видимому, единственный метод, который может обеспечить необходимую чувствительность при исследовании минимального количества. Так, для спектрофона, использующего явление полного внутреннего отражения (рис. 7.9, б), объем ячейки составил 0,1 мм3, что (при мощности СО2-лазера, равной 2 Вт) обеспечило абсолютную чувствительность определения SF6 в атмосфере Не порядка 2 нг. Работа устройства основана на поглощении неоднородной приповерхностной волны, проникающей из более плотной в менее плотную среду в условиях полного внутреннего отражения. Оптимизация размеров ячейки позволяет снизить ее объем до 0,25 мкл, т. е. повысить чувствительность до 5 пг.

Важным преимуществом миниатюрных ячеек является возможность работы на сравнительно высоких частотах модуляции (0,1–1,3 кГц), так как время тепловой релаксации ячейки уменьшается пропорционально площади ее поперечного сече-

344 Гл. 7. Оптико-калориметрическая спектроскопия биообъектов

поверхность ячейки хорошо отполирована, в результате поглощение света поверхностью сводится к минимуму. Ячейка закрыта кварцевыми окнами с помощью кольцевых тефлоновых прокладок. Именно эти материалы — нержавеющая сталь, кварц и тефлон — оказываются предпочтительными при конструировании спектрофонов, поскольку обеспечивают минимальное загрязнение исследуемых веществ. Благодаря простоте конструкции довольно широкое распространение получила жидкостная ячейка, выполненная на основе пьезокерамического цилиндра, который одновременно является и боковой стенкой ячейки, и приемником ОА-сигнала (рис. 7.10, а). С помощью такой ячейки была достигнута чувствительность устройства по µa, равная 2,2 · 10−5 см−1. Одна из схем открытой ячейки показана на рис. 7.3. При

определенных условиях, например, при рас-

отражающее рассеянный в жидкости свет, а металлическое основание размещают

всреде, поглощающей акустические колебания. Другая конструкция содержит кварцевую кювету с полированными стенками, размерами 1 × 1 × 5 см3, толщина стенок 1 мм. Акустическая связь кюветы с ПЗП обеспечивается с помощью резиновой прокладки. Конструкция быстродействующего спектрофона со стандартной кюветой (см. рис. 7.11) содержит пленочный детектор акустических колебаний на основе по-

ливинилиденфторидной (ПВФ2) пьезоэлектрической пленки толщиной 20 мкм и диаметром 5 мм. Пленочный детектор зажат между алюминиевой фольгой, служащей

вкачестве одного из электродов детектора, и металлическим цилиндром с диаметром 4 мм и высотой 3 мм, который, в свою очередь, соединен с алюминиевым цилиндром и далее с первым каскадом преобразователя импеданса с полосой 0,5 Гц – 35 МГц. Для осуществления акустического контакта между дном кюветы и поверхностью

алюминиевой фольги, а также между металлическим цилиндром и ПВФ2-пленкой находится тонкая пленка смазки.

Для спектроскопических исследований конденсированных сред удобными в эксплуатации оказываются ОА-зонды для открытых ячеек (рис. 7.10, д). Основной элемент зонда — стержень из плавленого кварца диаметром 8 мм, длиной 20 см — представляет собой акустический волновод. К стержню с помощью клея прикреплен ПЗП (диаметр 12,7 мм, толщина 3 мм), который фиксируется диэлектрическим винтом. Эта часть устройства размещена в металлической коробке, являющейся электрическим экраном. Резиновая прокладка уменьшает акустическую связь коробки и стержня. Стержень опущен в кювету с жидкостью, через которую на 0,3 см ниже нижнего среза зонда пропускается лазерный луч. Такой зонд удобен для применения

вбиологии и медицине. Его достоинства заключаются в том, что импульсы света и звука сдвинуты во времени, преобразователь акустических колебаний удален от источника колебаний, его устройство допускает охлаждение и работу с коррозирующими жидкостями.

Взависимости от решаемых задач при исследовании твердых тел возможны различные типы спектрофонов. Их можно разделить на три группы.

К первой группе относятся спектрофоны, в которых используется непосредственный контакт либо преобразователя, либо кварцевого звукопровода с исследуемым объектом с помощью акустически связующей тонкой пленки жидкости или пружины с резиновой прокладкой. Такие спектрофоны хороши для измерения коэффициентов поглощения в объемных телах (см. рис. 7.3) или в порошках, или в тонких пленках (рис. 7.12, а, б). Ослабление влияния рассеянного света, вызывающего фоновый сигнал, обусловленный пироэлектрическим эффектом, на датчик достигается за счет сложной конфигурации звукопровода. Устранить влияние рассеянного света можно либо напылением зеркального слоя в месте контакта звукопровода с пьезоэлектрическим элементом, либо использованием дифференциальной схемы с двумя пьезоэлементами, один из которых механически не связан со звукопроводом, но облучается рассеянным излучением той же интенсивности, что и рабочий.

Основой датчика, удобного для исследования ОА-спектров в условиях низких температур, является кварцевый блок с размерами 2,50 × 1,20 × 0,18 см3, который зажимается между медной скобкой и ПЗП (рис. 7.12, в). Малые габариты датчика позволяют размещать его целиком в криостате. Датчик был использован для исследования ОА-спектров порошков, растворенных в глицерине при температуре 10 К. Он прост в изготовлении и может найти применение в биологических исследованиях при низких температурах.

Ко второй группе спектрофонов относятся газовые ячейки, в которых ОА-сигнал возбуждается в газе за счет изменяющегося во времени нагрева твердого тела при поглощении им света и регистрируется с помощью обычных микрофонов. На рис. 7.12, г

Рис. 7.12. Конструкции спектрофонов, используемые при исследовании твердых тел [5, 329, 1223]: 1 — пучок света; 2 — пьезоэлектрический преобразователь; 3 — микрофон; 4 — образец; 5 — кварц; 6 — окошко; 7 — газ; 8 — липкая лента

показана ячейка, предназначенная для исследования поглощения в твердых образцах. Подстройка объема рабочей камеры, так же как и изменение давления газа, его состава и частоты модуляции, необходима для оптимизации ОА-сигнала как по амплитуде, так и по фазовому сдвигу. Интересный вариант спектрофона представлен на рис. 7.12, д. Дифференциальный микрофон смонтирован между двумя идентичными ячейками. В одну из них введен световод для освещения объекта, а в другую — винт, который позволяет изменять объем ячейки и добиваться минимума влияния фоновых сигналов. Такой детектор приклеивается липкой лентой к исследуемому объекту, например поверхности кожи человека.

Наконец, к третьей группе следует отнести конструкции, в которых жидкость используется в качестве преобразователя тепловых колебаний образца в акустические. Пример такой ячейки показан на рис. 7.3. Очевидно, что любую из открытых или закрытых жидкостных ячеек можно использовать для исследования твердых образцов при условии, что на границе жидкость — акустический датчик потери акустического сигнала малы. Описания различных типов ОА-ячеек, предназначенных для исследования газообразных и конденсированных сред, включая и биологические объекты, можно найти в работах [5, 58, 329, 1223, 1274–1317].

Резонансные явления в акустических резонаторах и конструкции резонансных спектрофонов описаны в работах [58, 329, 1223]. В резонансных спектрофонах реализуется значительное отношение объема ячейки к ее поверхности, что позволяет с большой надежностью работать с газами, поглощаемыми стенками ячейки.

Пространственное распределение акустических полей в соответствии с установившимися типами колебаний позволяет вводить необходимые конструктивные элементы (неоднородности), например трубки для ввода и вывода газа, в те места ячейки, где находится узел стоячей волны, не искажая ее. Более того, одним из важнейших направлений конструирования резонансных ОА-ячеек является устранение фоновых сигналов от окон и других элементов конструкции. Прием тот же самый: в акустическом резонаторе необходимо возбудить такой тип колебаний, чтобы в области локализации окон и этих элементов стоячая волна имела узел.

Типичные значения частоты и добротности акустических резонаторов: fp = 102–

104 Гц, Q = 102–103. Сравнительно высокая частота колебаний снижает амплитуду ОА-сигнала (см. (7.15)). Причем уменьшение амплитуды не может быть полностью скомпенсировано увеличением добротности резонатора Q (для резонансных ячеек в формулу (7.15) необходимо подставить частоту рабочего резонатора и умножить на Q). С другой стороны, увеличение частоты способствует повышению быстродействия и увеличению отношения сигнал/шум измерительного устройства. В принципе, любая из конструкций, представленных на рис. 7.9–7.12, будет проявлять резонансные свойства на определенных частотах; однако ячейки не оптимизированы по своим резонансным свойствам, и поэтому акустические резонансы, возникающие в системе, являются мешающим фактором. Изменив размеры, например цилиндрической ячейки (см. рис. 7.9, а), можно добиться возбуждения в ней требуемого типа колебаний.

Сравнительно низкие резонансные частоты, возможность управления параметрами имеют так называемые резонаторы Гельмгольца. Они успешно применяются при исследовании как газообразных, так и конденсированных сред. Особенно полезными они оказываются при исследованиях поглощения в твердых телах и жидкостях при низких температурах. В таких случаях используются протяженные ячейки, т. е. микрофонный отсек, содержащийся при комнатной температуре, соединяется узким длинным каналом с рабочим отсеком, находящимся в криостате. Чем длиннее соединительный канал, тем отчетливее резонанс. Снижение температуры образца позволяет существенно (более чем на три порядка) увеличить чувствительность метода, частота резонанса f0 T 1/2, где T — температура буферного газа, а добротность Q T −1. Одна из конструкций резонатора Гельмгольца, применяемая для исследования биологических тканей, представлена на рис. 7.12, е.

Проблема воспроизводимости результатов измерений, выполненных ОА-методом, связанная с резонансными свойствами системы, является одной из основных. Например, низкая воспроизводимость результатов регистрации импульсного ОА-сигнала, полученного от стандартных кювет высотой 5 см (см. рис. 7.10, в), была обусловлена низкочастотным внешним акустическим шумом, асинхронным с лазерным импульсом. Очень простой прием, заключающийся в уменьшении высоты кюветы до 2 см, позволил существенно снизить влияние окружающих шумов. Поскольку кювета представляет собой своеобразную антенну для приема акустических колебаний, частота собственных колебаний которой зависит от ее высоты, то уменьшение высоты ячейки увеличивает резонансную частоту и уводит ее из области сильных акустических шумов.

В качестве приемников акустических сигналов наибольшее распространение получили микрофоны различных конструкций: цилиндрические, плоские, конденсаторные, а также электретные. Неравномерность частотной характеристики и уровень шумов электретных микрофонов несколько выше, чем у конденсаторных, однако электретные микрофоны имеют малые размеры и не требуют источника напряжения поляризации. Чувствительность лучших микрофонов составляет 50–100 мВ/Па.

348 Гл. 7. Оптико-калориметрическая спектроскопия биообъектов

Наряду с микрофонами для приема акустических колебаний непосредственно от жидкостей и твердых тел применяются разнообразные пьезоэлектрические преобразователи, чувствительность которых составляет 0,01–1,00 мВ/Па. На рис. 7.3 схематически показана одна из конструкций таких преобразователей. Она состоит из куска плавленого кварца Т-образной формы диаметром 0,63 см и длиной каждого плеча 2,5 см. На нижнюю часть вертикального отростка нанесено отражающее покрытие, на которое приклеен пьезокерамический цилиндр. Эта часть приемника защищена латунным стаканом, который выполняет также функции электрической экранировки. Кварцевый блок сделан таким, чтобы, обеспечивая хорошую проводимость для звуковых волн, свести к минимуму влияние рассеянного лазерного излучения на работу пьезопреобразователя. Собственная резонансная частота ОА-детектора — 250 кГц.

В работе [1223] дано описание другого типа универсального ОА-детектора, изготовленного в виде болта, ввинчивающегося в боковую стенку закрытой жидкостной ячейки или соприкасающегося со стандартной кюветой (см. рис. 7.10, г), с кварцевыми звукопроводами (см. рис. 7.12, а, б) с помощью струбцины.

Другая очень простая конструкция ОА-детектора представляет собой пьезокерамический параллелепипед с поперечным сечением S = 0,7 × 0,5 см2 и длиной d = 1,27 см. На две грани параллелепипеда напылены электроды, и одной из них

торого закрыта тонкой диафрагмой диаметром 2,54 см. Собственная частота колебаний резонатора равна 505 Гц. На данной частоте модулируют интенсивность излучения (например, СО2-лазера со средней мощностью 1 Вт, λ = 10,6 мкм), которое поглощается смесью газов, заполняющих спектрофон. Возникающий ОА-сигнал приводит к соответствующим колебаниям кривизны поверхности диафрагмы параболической формы, что вызывает периодическую фокусировку и расфокусировку пучка излучения измерительного Не–Nе-лазера, интенсивность излучения модулируется на частоте 50 кГц с помощью акустооптического модулятора. Отраженное от диафрагмы излучение принимается фотоприемником с ограниченной апертурой, находящимся на расстоянии 1,6 м от спектрофона. Сигнал с фотоприемника регистрируется на

частоте 50 кГц с огибающей, пропорциональной ОА-сигналу на частоте 505 Гц. Чувствительность лазерного шлирен-микрофона не хуже чувствительности электретного микрофона; имеется возможность улучшения чувствительности устройства.

Рис. 7.14. Лазерные и волоконно-оптические приемники ОА-сигналов [329]: 1, 2 — возбуждающий и пробный лазерные пучки; 3 — фотоприемник; 4 — модулятор; 5 — окошко; 6 — нож; 7 — смеситель; 8 — компенсатор; 9 — анализатор спектра

В качестве «приемника» акустической волны можно также использовать пробный лазерный пучок, отклоняющийся за счет изменения показателя преломления (концентрации частиц) в области прохождения акустической волны (рис. 7.14, б) [1223, 1317]. Отклонение лазерного пучка регистрируется с помощью оптического ножа и фотоприемника. Изменяя расстояние между рабочим и пробным лазерными пучками и регулируя длительность импульса возбуждения, можно выделить акустический сигнал и измерить скорость распространения звука в различных средах.

Волоконно-оптический акустический приемник содержит катушку волоконного световода, размещенную внутри газовой или жидкостной ячейки, освещаемой лазерным пучком и включенной в одно из плеч лазерного волоконно-оптического интерферометра, возбуждаемого другим лазерным пучком (рис. 7.14, в). Потенциально волоконно-оптические датчики имеют чрезвычайно высокую чувствительность к акустическим возмущениям (их предельная чувствительность обусловлена броуновскими шумами).

Рассмотрим динамические калориметрические системы. Важным классом диагностических задач в биологии и медицине является анализ перемещающихся газовых и жидкостных потоков, например, газовая или жидкостная хроматография, исследование кровотока, счет одиночных биочастиц (осколки биомолекул, клетки) и пр. В потоках по сравнению со случаем неподвижного вещества меняется характер тепловой диффузии. Время тепловой релаксации вместо уравнения (7.11) определяется следующим соотношением [5, 1292]:

где aпT = av df — «потоковый» коэффициент диффузии; a — экспериментально определяемый коэффициент (3 · 10−2–4 · 10−2); v — сдвиговая скорость; df — диаметр потока. Для типичных условий aпT = 7,7 · 10−3 × vr (v — скорость потока, r — его радиус).

Некоторые примеры динамических калориметрических систем схематически показаны на рис. 7.15 [1292]. Для динамических измерений в потоках можно исполь-

зовать также традиционные схемы (см. рис. 7.9, а, б; 7.10, а, б). Выбор оптимального соотношения между скоростью потока, частотой модуляции света и расстоянием между зонами возбуждения и регистрации позволяет в схеме (рис. 7.15, а) достичь пороговой чувствительности по поглощению на уровне 10−7 см−1. Дифференциальный пироприемник в данной схеме исключает влияние рассеянного излучения. Схема (рис. 7.15, б) перспективна для применения в жидкостной капиллярной хроматографии. Другая схема (рис. 7.15, в) предназначена для детектирования одиночных частиц, которые, попадая при своем движении в область жесткой фокусировки лазерного пучка, скачком сильно увеличивают амплитуду ОА-сигнала. Эта схема имеет высокое пространственное разрешение, высокую чувствительность и возможность одновременного измерения скорости потока, концентрации поглощающих частиц и температуры среды. Она имеет значительный динамический диапазон (0,1–100,0 см/с) и возможность определения профиля скоростей в сечении потока.

Рис. 7.15. Динамические калориметрические системы [1292], реализующие: а — оптико-тер- мический метод с дифференциальным пироприемником (1 — поток, 2 — возбуждающий лазерный пучок, 3 — пироприемник с изолированной от теплового потока частью приемной площадки); б — ОА-метод с пьезоэлектрической регистрацией (3 — пьезодатчик); в — ОА-ме- тод регистрации одиночных частиц в газах и жидкостях (3 — микрофон или пьезодатчик); г — дефлекционный метод в потоках (3 — позиционно-чувствительный фотоприемник, 4 —

пробный лазерный луч)

7.4.Области применения оптико-калориметрических методов

вбиологии и медицине

Высокая чувствительность, возможность получения значительного разрешения при использовании лазеров в качестве источников излучения, локальность анализа, применимость для исследования веществ в различных агрегатных состояниях и малых объемах, простота обработки результатов и возможность автоматизации делают ОА-метод и другие оптико-калориметрические методы исследования уникальными

7.4.Области применения оптико-калориметрических методов в биологии и медицине 351

сточки зрения областей их применений в биологии и медицине. Они применяются при газовом анализе, необходимом для контроля процессов дыхания и питания микроорганизмов и клеток; анализе загрязнений атмосферы и гидросферы; анализе лекарственных препаратов и биологических сред в виде порошков и тонких пленок; контроле фотохимических, биохимических и иммунологических реакций; изучении фотохромных биологических сред; в лабораторной медицинской диагностике и определении оптических параметров биотканей; в проточной цитометрии in vivo; опти- ко-акустической микроскопии и томографии в офтальмологии, дерматологии и др. [5, 12, 13, 31, 34, 41, 58, 150, 159, 329, 330, 363, 365–368, 372–380, 1223, 1274–1356].

Выделение разнообразных газов в процессе жизнедеятельности человека, животных, микроорганизмов и клеток является важнейшим показателем характера протекания соответствующих биохимических реакций. Поэтому контроль состава и концентрации выделяющихся газов представляет важную задачу в биохимических исследованиях, а также в диагностике некоторых заболеваний. Задача газового анализа сводится к анализу многокомпонентной смеси газов, имеющих, как правило, малые коэффициенты поглощения в видимой и ближней ИК-областях спектра. Применение метода абсорбционной спектроскопии в данном случае требует длины столба газа в несколько десятков и сотен метров (см. главу 6), что в биологическом эксперименте обеспечить трудно. Необходимо также высокое спектральное разрешение для разделения вклада отдельных компонентов в спектры поглощения. Эти проблемы исключаются при использовании ОА-метода, в котором в качестве источников света применяют перестраиваемые лазеры. В ИК-области спектры поглощения паров воды, окиси азота, метана регистрируются с помощью дискретно перестраиваемых

DF- (3,5–4,0 мкм) и СО2- (9,1–11,3 мкм) лазеров. При исследовании многоатомных молекул видимая область спектра поглощения интересна для определения их концентрации в многокомпонентной смеси. Она формируется за счет колебательных обертонов высокого порядка, и поэтому интенсивность поглощения чрезвычайно мала. В данном случае ОА-метод с использованием перестраиваемых лазеров на красителях оказывается одним из наиболее надежных методов исследования. Методом внутрирезонаторной ОА-спектроскопии, обеспечивающим при использовании лазеров

на красителях частичное разрешение вращательной структуры полос колебательного поглощения (1 см−1), удается получить наиболее полные спектры обертонного колебательного поглощения (вплоть до 7–9 порядков) таких многоатомных молекул, как

НСl, небольших органических молекул типа С6Н6, модификаций метанола СН3ОН, СН3ОD и SiНD3 в газовой фазе.

Имеется возможность исследования паров азулена с помощью ОА-кюветы

(см. рис. 7.9, в) с высокой точностью, определяемой шириной линии генерации импульсного лазера на красителях с ламповой накачкой, и высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать ОА-спектры даже при комнатной температуре при длине пути поглощения, равной всего 1 мм. Ранее для получения спектра поглощения азулена в паровой фазе с той же чувствительностью и меньшим разрешением требовалась длина пути поглощения, равная 4 м (абсорбционно-трансмиссионный метод).

Описанные методы линейной спектроскопии с применением перестраиваемых лазеров позволяют проводить анализ многокомпонентных смесей газов, включая и изотопы. В ОА-спектроскопии существуют и другие подходы к решению задачи газового анализа. Например, перспективным является сочетание ОА-метода и метода газовой хроматографии, обеспечивающее анализ предварительно разделенных компонентов исследуемой смеси. Высокая эффективность ОА-детектирования в газовой хроматографии продемонстрирована на примерах селективного анализа изомеров бутилового спирта и ксилолов, определения содержания трансизомеров жирных кислот