Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

332 Гл. 7. Оптико-калориметрическая спектроскопия биообъектов

объекта, а также для неоднородных (слоистых) объектов приведены в работе [1303]. Как правило, зондирующее излучение достаточно глубоко проникает в биоткань и создает там соответствующее распределение температуры, которое связано с из-

меряемой поверхностной температурой, поэтому регистрация ОТР-сигнала в зависимости от времени (непосредственно после окончания лазерного импульса) позволяет восстановить распределение температуры в объеме и тем самым визуализировать скрытые неоднородности ткани, обусловленные локальными изменениями коэффициента поглощения на длине волны зондирующего излучения.

Так же как и в методе волн фотонной плотности (см. главу 2), применение лазеров непрерывного действия с модуляцией выходной мощности позволяет получить информацию о характере поглощения исследуемого вещества из измерений сдвига фаз между переменными составляющими мощности излучения лазера и давления Φ(ω). При гармонической модуляции мощности излучения, P , для газообразных сред имеем

ношением (7.11). Эти выражения получены при тех же предположениях, что и (7.10). Изучение оптических и тепловых свойств жидкостей и твердых тел с помощью газовой ОА-ячейки (косвенный метод) является довольно распространенным методом исследования. Свет, модулированный с частотой ω, поглощается конденсированной средой и частично преобразуется в тепло, создающее возмущения давления в окружающем газе, которые регистрируются микрофоном. В основу описания ОА-сигнала по такой схеме положено решение уравнения теплопроводности в предположении, что амплитуда и фаза колебаний в газе определяются не зависящими друг от друга возмущениями температуры в исследуемом образце и газе. Эта модель справедлива лишь в той области частот модуляции (большие частоты), где термодиффузионная длина в газе lTg значительно меньше длины столба газа lg. Термодиффузионная

(тепловая) длина определяется соотношением

Расширение области применения теории до произвольно малых частот и малых столбов газа показывает, что нижний предел lTg (или lg) должен быть того же порядка, что и величина средней длины свободного пробега молекул газа. В области малых значений «тепловой» толщины газа необходимо принимать во внимание дополнительный объем Vr, например объем газа в канале, соединяющем рабочую часть ячейки с микрофоном.

При описании ОА-сигнала используют три характерные длины образца: геометрическую d, длину пробега фотона в поглощающей среде lph = 1/µa и «тепловую» lT (см. (7.17)). В зависимости от соотношения длин возможны шесть различных вариантов газомикрофонного метода. Различают оптически и термически толстые среды. Очевидно, что для d > lT ≈ lph возможны эффекты насыщения амплитуды ОА-сигнала, которые следует избегать [58, 1223]. Для данного образца величина lT

определяется длительностью импульса или частотой модуляции ω. Для оптически прозрачных или почти прозрачных образцов (d ≈ lph + lT) в формировании ОА-сиг- нала участвует также обратная сторона объекта, поэтому, кроме указанных шести, возможны и другие варианты.

Все сказанное относится, главным образом, к ячейкам закрытого типа, когда жидкость или газ ограничены в некотором замкнутом объеме. Более удобными, особенно для целей диагностики биообъектов in vivo и in situ, являются ячейки открытого типа. Кроме того, ячейки открытого типа позволяют более простыми средствами разделять вклады в ОА-сигнал от поглощения в объеме и на поверхности исследуемого объекта. Если в закрытой ячейке для этого необходимо проводить измерения в широком диапазоне частот модуляции, то при использовании открытой ячейки достаточно измерить амплитуду и фазу ОА-сигнала на одной частоте [329].

При условии, что свет полностью поглощается поверхностью биообъекта, сдвиг фазы ОА-сигнала, возникающего за счет преобразования прошедшей через биообъект и подложку тепловой волны, определяется соотношением [1278]

где R = (1 − b)/(1 + b); b = (kbρbcb/kρc)1/2; lT — термодиффузионная длина биообъекта, определяемая соотношением (7.17); d — геометрическая длина биообъекта (индексом b отмечены параметры подложки).

Наиболее простой вид это соотношение имеет в двух случаях: когда объект термически толстый (d lT), или когда подложка и объект имеют близкие свойства (b ≈ 1):

(7.19)

При осуществлении такого простого способа определения lT, а следовательно aT или плотности биообъекта ρ (см. (7.11)), для слабопоглощающих биообъектов можно использовать схему с облучением обратной стороны объекта, поверхность которой покрыта поглощающей свет пленкой или металлической фольгой. Возникающая на поверхности тепловая волна, пройдя биообъект, преобразуется в звук на другой его поверхности (граница биообъект — воздух), а звук принимается микрофоном. В случае термически тонких объектов можно использовать подходящую подложку, контактирующую с неосвещаемой поверхностью биообъекта. Для большинства биотканей такой подложкой может служить жидкий парафин, а поглотителем — медная фольга толщиной 5 мкм [1278]. В рассматриваемом варианте фазовый метод наиболее интересен для визуализации внутренней структуры биообъектов, определяющей неоднородность тепловых свойств в объеме объекта.

7.2. Экспериментальные исследования и типичные измерительные установки

Типичные схемы экспериментальных установок для исследования ОА-спектров веществ в различных фазовых состояниях представлены на рис. 7.2 и 7.3. Установка, показанная на рис. 7.2, может быть использована для исследования как жидкостей, так и газов при импульсном возбуждении. При исследовании газов необходимо предусмотреть систему откачки и напуска газов с заданной концентрацией, а в качестве приемника ОА-сигналов обычно используют конденсаторный или электретный микрофоны или пьезоэлектрический преобразователь (ПЗП). В работе [1223] аналогичную установку применяли для исследования спектров поглощения

жидкостей. В качестве источника света, перестраиваемого по длинам волн, брали лазер на красителях с ламповой накачкой. Область перестройки лазера в диапазоне 450–750 нм обеспечивалась сменными красителями. Длительность импульса τи составляла 2 · 10−6 с, максимальная энергия E — 10−3 Дж, частота повторения f — 10–20 Гц. В качестве приемника ОА-сигнала служил пьезоэлектрический преобразователь. Выходной сигнал с ПЗП через быстродействующий предварительный усилитель поступал на основной усилитель, а затем усреднялся за определенный промежуток времени с помощью стробируемого вольтметра (A). Необходимость такого усреднения вызвана тем, что ОА-импульс оказывается дополнительно уширенным, что обусловлено как резонансными свойствами ПЗП, так и отражением ОА-сиг- нала от стенки ячейки. Пучок света, прошедший ОА-ячейку (обычно исследуются прозрачные жидкости), поступает на пироэлектрический детектор, сигнал с которого с помощью второго стробируемого вольтметра (B) преобразуется в опорный. Оба сигнала — ОА и опорный — оцифровываются и поступают на компьютер для дальнейшей обработки и получения нормированного ОА-сигнала. Информация о частоте генерации лазера также поступает на компьютер. Окончательно получают график зависимости амплитуды нормированного ОА-сигнала от частоты генерации лазера. Небольшая часть излучения лазера направляется на спектрометр, с помощью которого осуществляется калибровка частоты генерации по эталонным линиям в спектрах хорошо изученных газов. Точность калибровки совпадает с шириной линии генерации лазера (1 см−1) и является более чем достаточной для исследования жидкостей и твердых тел.

Рис. 7.2. Схема экспериментальной установки для ОА-спектроскопии газов и жидкостей [5, 329, 1223]: 1 — импульсный лазер на красителях; 2 — кварцевое окно; 3 — термопара; 4 — ОА-ячейка; 5 — пироэлектрический приемник лазерных импульсов; 6 — термостабилизированная кювета; 7 — приемник ОА-сигнала; 8 — сканирующее устройство, 9 — спектрометр; 10 — предварительный усилитель; 11 — усилитель; 12, 13 — стробируемые вольтметры; 14 —

компьютер; 15 — контрольное устройство и графопостроитель

Исследование поглощения в твердых телах возможно регистрацией возбуждаемого ОА-сигнала как при непосредственном контакте твердого тела с детектором, так и при размещении исследуемого тела в открытой ячейке, заполненной жидкостью (см. рис. 7.3). Лазер излучает импульсы на λ = 1060 нм с энергией E = 6 · 10−4 Дж,

длительностью τи = 10−7 с и f = 8 Гц. В первом случае возбуждающийся в образце

преобразователь акустических колебаний в электрические, 5 — усилитель; 6 — фильтр; 7 — АЦП; 8 — компьютер; 9 — окно; 10 — жидкость

акустический импульс через тонкую пленку глицерина, служащую элементом связи по акустическому каналу, попадает на ПЗП, преобразующий механические колебания в электрические. Выходной сигнал преобразователя усиливается, фильтруется в полосе 80–600 кГц, а затем поступает на аналого-цифровой преобразователь (АЦП), который открывается сигналом с фотодиода только на период действия лазерного импульса. Данные с АЦП поступают на компьютер, где ОА-сигнал усредняется по большому числу лазерных импульсов. Во втором случае исследуемый образец является задним окном жидкостной открытой ячейки, ОА-детектор расположен в жидкости вблизи поверхности образца. Жидкость, так же как и газ, может служить генератором акустических колебаний, обусловленных тепловыми процессами, возникающими при поглощении света в тонкой пленке на поверхности образца. Таким образом, в отличие от первого случая (где глицерин — всего лишь передатчик акустических колебаний), жидкость является как генератором, так и передатчиком колебаний; чувствительность метода увеличивается в пять раз при условии, что слой жидкости, разделяющий объект с датчиком, не превышает 50 мкм. Чувствительность жидкостного метода оказывается выше и по сравнению с газомикрофонным методом.

Визуализация структуры биообъектов может быть осуществлена с помощью экспериментальной установки, представленной на рис. 7.4 [1278]. Линейно поляризованное излучение Аr-лазера модулируется по интенсивности с помощью акустооптического модулятора и попадает на расширитель лазерного пучка, состоящий из двух линз. Проходя полуволновую пластинку, излучение поступает на поляризационный делитель пучка. Поворот полуволновой пластинки вокруг оси позволяет направлять излучение на заднюю сторону биообъекта. Прежде чем попасть на биообъект, излучение фокусируется с помощью линз с фокальной длиной 40 или 100 мм. Соответственно, диаметр сфокусированного пучка на объекте оказывается равным 40 или 100 мкм. Оба пучка направляются таким образом, чтобы нагревать одну и ту же точку биообъекта. Основной ОА-сигнал получают при облучении обратной (нижней) поверхности биообъекта, покрытой тонкой (5 мкм) медной фольгой. Освещение передней (верхней) поверхности используется для определения начальной точки сканирования исследуемого объекта. Сканирование осуществляется перемещением закрепленной на двухкоординатном (x–y) столике ОА-ячейки с помощью шаговых двигателей. ОА-сигнал от конденсаторного микрофона усиливается, поступает на фазовый детектор и далее на компьютер, который контролирует также положение точки

прием теплового излучения от биообъекта с обеих сторон (с передней и задней)

спомощью фотоприемников ИК-излучения и соответствующих оптических фильтров, вырезающих необходимый диапазон длин волн. Сигналы с фотоприемников усиливаются, оцифровываются и обрабатываются на компьютере. Результаты измерений после накопления и обработки в представляются в удобном виде на графопостроителе или мониторе.

На рис. 7.6 показаны схема принципа действия и экспериментальная установка метода «тепловой линзы» [1277, 1318]. Излучение возбуждающего импульсного лазера на красителях через поворотную призму (минуя призму 3) поступает в кювету

сисследуемым веществом. При поглощении излучения в веществе формируется «тепловая линза» за счет поперечного теплового вытеснения вещества с оси пучка к его краям в соответствии с гауссовым профилем пучка. Прошедшее кювету излучение частично задерживается диафрагмой 5 и полностью гасится фильтром 6. В зависимости от длины волны возбуждающего лазера величина поглощения меняется, тем самым меняется оптическая сила наведенной линзы. Информацию об оптической силе линзы получают с помощью непрерывного Не–Nе-лазера и точечной диафрагмы 5, поскольку при изменении размеров пробного пучка изменяется интенсивность прошедшего через диафрагму света, который фиксируется фотоприемником 7 и далее регистрирующей и обрабатывающей аппаратурой 14–17.

Рис. 7.6. Метод «тепловой линзы»: экспериментальная установка (а); схематическое представление принципа действия метода (б) [1277]: 1, 3 — поворотные призмы; 2, 9 — линзы; 4 — кювета с исследуемым веществом; 5 — точечная диафрагма; 6 — фильтр; 7 — фотоприемник; 8 — пироэлектрический приемник; 10 — возбуждающий лазер на красителях; 11 — Не–Nе-лазер (пробный пучок); 12 — АИГ:Nd-импульсный лазер; 13 — источник накачки;

14 — осциллограф; 15 — усилитель; 16 — система записи сигнала; 17 — компьютер

Следующая установка (рис. 7.7) реализует один из вариантов косвенного дефлекционного метода и служит для контроля процесса разрушения желчных камней излучением мощного лазера на красителях с ламповой накачкой [1282, 1290]. Лазер обеспечивал плотность энергии в диапазоне 12–150 Дж/см2, имел τи ≈ 0,8 мкс и перестраивался в диапазоне 450–700 нм. Его излучение через согласующую оптику и кварцевый световод с диаметром сердцевины 320 мкм поступало к объекту. Измерительная плексигласовая цилиндрическая кювета высотой 35 см и диаметром 5 см имела прямоугольный внешний выступ в днище размером 2 × 6 см, который служил в качестве преобразователя волн механического напряжения, возникающих при поглощении импульсного излучения лазера. Исследуемый объект — камень желчного пузыря — располагался на дне кюветы и заливался необходимым количеством воды. Волны механического напряжения при распространении по кювете

ностях зеркальными покрытиями (полностью отражающими — 4 и с 50 % отражением — 5). Линзы 9 служат для фокусировки излучения пробного и возбуждающего лазерных пучков на объект (пучки взаимно ортогональны). В интерферометр введен также управляемый от руки фазовый компенсатор, который обеспечивает подстройку разности фаз в плечах интерферометра. Конструкция интерферометра такова, что он автоматически за счет двойного прохода пробного пучка света через образец компенсирует дефлекционные эффекты и в два раза увеличивает чувствительность к фазовым возмущениям. Эти возмущения создаются излучением более мощного Не–Nе-лазера. Линейность фоторефрактивного сигнала наблюдается в диапазоне от 0,05 до 16 мВт выходной мощности возбуждающего лазера.

Шумы установки, обусловленные флуктуациями интенсивности излучения лазеров и шумами электроники, определяют ее чувствительность, которая при условии, что для газов dn/dT ≈ 10−5 1/ ◦C, для жидкостей — 10−7 1/ ◦C и твердых тел — 10−6 1/ ◦C, оказывается соответственно равной 10−6 ◦C в газах, 10−8 ◦C в жидкостях и 10−7 ◦C в твердых телах (см. (7.8)). Таким образом, рассмотренная интерференционная установка может регистрировать весьма малые изменения температуры, вызванные поглощением лазерного излучения.

ВИК-области спектра исследование спектров поглощения непрозрачных и сильно рассеивающих биообъектов можно проводить с помощью хорошо развитого и аппаратно обеспеченного метода фурье-спектроскопии при использовании в качестве неселективного детектора поглощенного в объекте ИК-излучения любого из рассмотренных оптико-калориметрических (ОК) преобразователей. Однако на практике лучше использовать простые и высокочувствительные оптико-акустический (ОА) или оптико-термический (ОТ) преобразователи. Современные промышленные ИК-фу- рье-спектрометры имеют выходной рабочий пучок (см. рис. 6.8), поэтому они легко совмещаются с ОАили ОТ-детекторами.

Впринципе существует возможность прямого определения абсолютного значения коэффициента поглощения вещества, если известны все значения коэффициентов передачи в системе источник света — поглощающее вещество — ОА-ячейка — преобразователь акустических колебаний — электронная схема. Однако это весьма трудная задача, поэтому обычно для определения абсолютных значений коэффициентов поглощения применяют калибровку ОА-детекторов или других типов ОК-прием- ников. При исследовании жидкостей процесс калибровки заключается в сравне-

нии, например, ОА-сигналов, полученных от исследуемой жидкости и жидкости с растворенным в ней красителем. Таким способом можно определить коэффициент поглощения с точностью ±10 %. Калибровка одной жидкости по другой с учетом коэффициента объемного расширения, теплоемкости и скорости распространения звука в различных жидкостях дает точность ±30 %. При исследовании поглощения в газах обычно применяется аналогичная методика калибровки с использованием эталонных газов с известным коэффициентом поглощения, а в твердых телах для эталонирования можно использовать калориметрический метод (при замещении объекта эталонным источником тепла), обладающий высокой чувствительностью (вплоть до значения µa = 5 · 10−6). Калибровка ОК-спектров твердых тел и жидкостей может быть произведена также с помощью стандартных образцов (задымленной кварцевой пластины). Основными причинами, снижающими реальную чувствительность ОК-ме- тода, являются: поглощение света в окнах ячейки, рассеяние света с последующим его поглощением стенками ячейки или непосредственно элементами приемника акустических сигналов, электрострикция исследуемого вещества под действием сильного лазерного поля. Эти причины вызывают фоновые сигналы [58, 1223].

Поглощение в окошках ОА-ячейки складывается из поглощения, обусловленного загрязнениями вещества (в том числе за счет диффузии газа или жидкости) и дефек-

тами в поверхностном слое окон, и поглощения в объеме окон. Поглощение в окошках приводит к дополнительному изменению давления в исследуемом газе или жидкости. Поскольку амплитуда фонового сигнала не зависит от поглощающей способности исследуемого газа (жидкости), фоновый сигнал может быть исключен из общего сигнала, например с помощью регистрирующего электронного устройства. Тем не менее, из-за ограниченного динамического диапазона электронных усилителей фоновые сигналы должны быть минимизированы. Для снижения влияния фоновых сигналов на полезный сигнал в газовой ячейке необходимо уменьшать поглощение в тонком поверхностном слое окон, что достигается соответствующей обработкой поверхности (полировка, очистка), а также взаимным подбором материала ячейки и исследуемого вещества.

При исследовании жидкостей и твердых тел существенное влияние на формирование фоновых сигналов может оказать рассеяние света. Очевидно, что в данном случае необходимо по возможности устранять образования, рассеивающие свет (частицы пыли, дефекты, неоднородности и т. п.). Кроме того, при импульсном режиме работы хороших результатов можно достичь стробированием измеряемого сигнала, так как рассеянный свет поглощается в элементах преобразователя практически мгновенно после действия лазерного импульса, а полезный акустический сигнал задерживается на время τd, определяемое выражением (7.9). В свою очередь, ОА-сигнал от окна приходит несколько позже основного сигнала от жидкости (газа). В этом и заключается основное достоинство импульсного метода при использовании его для анализа конденсированных сред. Хорошие результаты дает применение частотной модуляции излучения непрерывных лазеров или переключение их длин волн вблизи линии поглощения исследуемого вещества, поскольку благодаря сравнительно слабой дисперсии материала окон и стенок ячейки они дают малый вклад в ОА-сигнал [58, 293].

Сигнал, обусловленный эффектом электрострикции в лазерном пучке, возникает одновременно в том же объеме, что и полезный сигнал, и поэтому не может быть выделен стробированием. Эффект электрострикции обнаруживается при µa ≈ 10−6 см−1. Тем не менее, благодаря слабой его зависимости от длины волны, существует возможность исключения его влияния на форму ОА-спектра исследуемого вещества. Таким образом, реальная чувствительность ОА-метода составляет 10−6–10−7 см−1. В то же время применение специальных мер по устранению фоновых сигналов в газах позволяет получить чувствительность метода µa, равную 10−9 см−1. Данные по чувствительности ОА-метода и других калориметрических методов и их модификаций представлены в табл. 7.1 [5, 58].

7.3. Конструкции спектрофонов и зондов

Рассмотрим нерезонансные спектрофоны и зонды [5, 58, 329, 1223]. Под нерезонансным спектрофоном понимают такую ОА-ячейку, которая не обладает заметными резонансными свойствами. Такие ячейки целесообразно применять при импульсном возбуждении, а также в тех случаях, когда объем исследуемого вещества очень мал или когда в качестве информационного сигнала используется фазовый сдвиг (см. (7.16)). Наиболее простой и самой распространенной конструкцией спектрофонов, используемой при исследовании газов, является цилиндр с прозрачными для лазерного излучения окнами на торцах и с микрофоном в боковой стенке цилиндра (рис. 7.9, а).

Увеличения чувствительности можно добиться оптимизацией формы ячейки или многократным пропусканием лазерного пучка через ячейку [1223]. В первом случае стремятся, насколько это возможно, уменьшить эффективное сечение ячейки, так как амплитуда ОА-сигнала, согласно (7.10) и (7.15), обратно пропорциональна сечению (R2). Однако для снижения влияния стенок отношение радиусов светового пучка