Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

в образцах пищевых жиров, детектирования гербицидов и пр. [1293]. Используются также специфические особенности ОА-метода, заключающиеся в изменении ОА-сигнала в зависимости от параметров буферных газов (непоглощающих газов), их молекулярного веса, изотопного состава, теплоемкости, теплопроводности и вязкости. Обычно применяют резонансные спектрофоны, для которых свойства буферных газов проявляются в смещении резонансной частоты, обусловленном изменением скорости звука в смеси, и изменении добротности акустического резонатора за счет различных механизмов затухания в буферных газах.

При анализе загрязнений атмосферы в полной мере реализуются достоинства ОА-метода: высокая чувствительность и чрезвычайно широкий динамический диапазон. Для газов, присутствующих в атмосфере, динамический диапазон по параметру µad составляет 10−7–10−1 при длине кюветы 10 см. Нижний предел определяется чувствительностью спектрофона, а верхний — процессами насыщения. Широкий динамический диапазон позволяет с помощью одного и того же устройства регистрировать следы веществ, загрязняющих атмосферу (малые уровни), и источники загрязнения (большие уровни). Поскольку метод позволяет регистрировать загрязнения в ограниченном объеме (локально) и в реальном масштабе времени, то обеспечивается возможность анализа динамики поступления и ухода примесей в исследуемом объеме. Например, используя дискретно перестраиваемые СО- и СО2-ла- зеры, оказывается возможным регистрировать многие из обычных индустриальных загрязнений атмосферы (СО, NО, NО2, NН3 и т. д.) на уровне их концентрации порядка нескольких частей на миллион (ppm).

В многоволновом газоанализаторе на основе внутрирезонаторной ОА-спектро- скопии с использованием СО-, СО2- и Не–Nе (3,39 мкм) лазеров для устранения фоновых сигналов была применена модуляция длины волны [1294]. В зависимости

от используемого лазерного модуля пределы обнаружения примесей (NО, NО , NН ,

P 3 2 3

С2Н4, СnН2n+2) в газе при атмосферном давлении составляют 0,1–10 ррb, дина-

мический диапазон газоанализатора — 102–105. С помощью компактного волноводного СО2-лазера с поперечной ВЧ-накачкой можно обеспечить диагностику загрязнений от гидразивного топлива и токсических индустриальных веществ на уровне 1–100 ррb.

Отсутствие плавно перестраиваемых лазеров с достаточной выходной мощностью

вИК-области спектра (2–15 мкм) несколько сдерживает широкое внедрение в практику ОА-метода анализа загрязнений атмосферы. В связи с этим перспективными считаются методы нелинейной фотоакустической спектроскопии, в частности активной спектроскопии комбинационного рассеяния. С их помощью определены пороги

обнаружения газов: СН4, СО2, NО2 и С2Н3Сl в атмосфере; они находятся в пределах 1–10 ррm [58, 329].

Применение ОА-метода перспективно также и для определения малых примесей

вжидкостях. Используются лазеры как непрерывного, так и импульсного действия. При работе двухволнового Аr-лазера и жидкостной ячейки (см. рис. 7.10, а) удалось зарегистрировать следы β-каротина в хлороформе на уровне 12 ррt (0,08 нг/мл). Аналогичная ячейка и Аr-лазер (514,5 нм) мощностью 0,5 Вт использовались для детектирования малых концентраций на уровне 14 ррt (0,02 нг/мл) Сd в пенициллине

после его экстракции в хлороформ, а также для анализа малых концентраций канцерогенных пищевых красителей в воде: 2,75 · 10−8 моль/л (0,7 ррb). Предел обнаружения витамина А в экстрактах из крови при возбуждении излучением импульсного азотного лазера (337,1 нм) составляет 1 ррt (2 пг/мл) [58, 329].

Считается, что импульсный метод может иметь более высокую чувствительность (порядка 1–10 ррt) при определении малых концентраций. Однако, чтобы

354 Гл. 7. Оптико-калориметрическая спектроскопия биообъектов

Метод «тепловой линзы», позволяющий проводить измерения с достаточно высоким временным разрешением, был использован для изучения квантового выхода Φ и времени жизни τ синглетного кислорода О2(1 g), сенсибилизированного гематопорфирином и его производными, растворенными в этаноле [1277], а также многими другими фотосенсибилизаторами, растворенными в бензоле. Квантовый вы-

ОА-диагностика аэрозолей, мутных и коллоидных растворов важна для качественного и количественного анализа загрязнений атмосферы и гидросферы микрочастицами природного и промышленного происхождения, для контроля за ходом разнообразных биохимических реакций, поскольку по сравнению с традиционно используемым для этих целей абсорбционно-трансмиссионным методом она дает возможность определять малые концентрации микрочастиц, обеспечивает локальность измерений и высокую точность за счет малого влияния эффектов светорассеяния.

Анализ атмосферных аэрозолей ОА-методом можно проводить непосредственно в газовом потоке или (с предварительной их концентрацией) на специальных фильтрах. В качестве источников излучения используют СО2-, Аr-, Не–Nе-, АИГ:Nd- и НF-лазеры, а также лазеры на красителях. Применяют резонансные и нерезонансные спектрофоны, дифференциальные схемы с двумя спектрофонами, калибровку осуществляют по эталонному молекулярному поглощению в газе. Исследовались аэрозоли в виде атмосферной, асбестовой и кварцевой пыли, ацетиленовых, дизельных и сигаретных дымов, выхлопов автомобильных двигателей. Характерные размеры частиц — 0,15–3 мкм. Порог обнаружения на λ = 514,5 нм приблизительно равен 10−6 г/м3 (ацетиленовые и дизельные дымы).

Анализ коллоидных растворов на примере количественного определения частиц ВаSО4 в воде показывает значительный динамический диапазон ОА-метода (почти три порядка величины) и его высокую чувствительность (5 нг/мл или 30 ррb) [58]. Применение ОА-зонда, подобного представленному на рис. 7.10, д, при импульсном его возбуждении излучением лазера на красителях позволило продемонстрировать возможность изучения седиментации частиц молекулярных или макроскопических размеров в гравитационном поле или в центрифуге [1296]. На примере исследования седиментации гуминовых кислот удалось определить динамику осаждения частиц разных размеров (0,08–0,50 мкм). С помощью спектрофона (см. рис. 7.15, в) можно регистрировать отдельные частицы пыли в сверхчистых растворителях.

Основные достоинства ОА-метода — высокая чувствительность и возможность работы в условиях значительного рассеяния света — реализуются при изучении поглощения света в порошках твердых тел и тонких пленках жидкостей. Наиболее чувствительные из рассмотренных выше методов регистрации ОА-сигнала позволяют измерять поглощение света по параметру µad на уровне 10−5–10−6, следовательно у веществ с коэффициентом поглощения порядка µa ≈ 103–102 см−1 можно регистрировать молекулярный монослой (d ≈ 10−8 см). Для анализа порошков необходим тщательный выбор технических условий эксперимента, способствующих устранению влияния рассеянного излучения. Газомикрофонный метод можно реализовать с помощью нерезонансного спектрофона (см. рис. 7.12, г). Для пьезоэлектрической регистрации сигнала наиболее подходят конструкции спектрофонов, представленные на рис. 7.12, а–в. Желательно, чтобы исследуемый образец был достаточно оптически

Имеется возможность обнаружения бактерий и определения различных состояний

вих развитии оптико-калориметрическими методами. Так, если в спектре Bacillus subtilis наблюдается сильно поглощающая область, около 410 нм, то бактерии существуют в виде спор; если она отсутствует, то бактерии находятся в вегетативном состоянии. В клетках, выделенных из цианобактерий Anabaema 7120, ОА-методом изучены циклический транспорт электрона в фотосистеме 1, процессы фиксации азота и дыхания.

Спомощью ОА-метода изучают воздействие медикаментов на микроорганизмы, например, действие антималярийного препарата на лиофильные клетки малярийных паразитов. Он не требует специальной подготовки таких образцов и позволяет проводить исследования in vivo. Еще одно успешное применение ОА-спектроскопии — это исследование фотоцикла бактериородопсина. Материалом для изучения служат суспензии пурпурных мембран Halobacterium halobium. Исследования возможны

вшироком интервале температур (90–300 К). С помощью частотной зависимости амплитуды ОА-сигнала можно различать модели энергетики фотоцикла бактериородопсина [329].

Сиспользованием импульсной ОА-спектроскопии с временным разрешением, равным 1,4 мкс, были проведены прямые измерения процессов запасания фотохимической энергии в интактных клетках фотосинтетических бактерий Rhodospirillum rubrum [1299]. Из сравнения ОА-сигналов при возбуждении каротиноидов на λ = 532 нм и бактериохлорофилла на λ = 590 нм оказалось возможным определить, что от 14 до 54 % квантов, поглощаемых каротиноидами, идет на возбуждение бактериохлорофилла путем синглет-синглетного преобразования энергии в фотореакционном центре.

Исследования с бактериородопсином можно проводить методом температурного скачка, который заключается в быстром импульсном лазерном разогреве водных суспензий и растворов биообъектов и наблюдении кинетики фотохимических процес-

сов [1300]. Наилучшим образом для этих целей подходит излучение АИГ:Еr-лазера

с λ = 2,94 мкм, попадающее в полосу поглощения воды (µa ≈ 104 см−1). Длительности импульсов лежат в пико- и наносекундном диапазоне, разогрев объекта составляет от нескольких градусов до десятков, толщина разогреваемого слоя — от нескольких микрон до десятков микрон.

Абсорбционно-трансмиссионная спектроскопия при исследовании крови, как правило, не дает удовлетворительных результатов из-за светорассеяния, обусловленного наличием липидных материалов в плазме и красных кровяных клеток (такие исследования оказываются возможными при значительном усложнении методик измерения и решения обратной задачи рассеяния (см. главы 1, 2 и 6)). В ОА-спектроскопии рассеяние света не играет решающей роли, поэтому методика исследований оказывается более простой. Например, для регистрации ОА-спектров крови в качестве источника света использовались Аr-лазер (мощностью 30–300 мВт) или ксеноновая лампа (300 Вт) [1301]. ОА-ячейка имела сапфировое окно, через которое осуществлялось освещение и которое служило звукопроводом. На одной кромке окна монтировался пьезоэлектрический кристалл. Конструкция позволяла так размещать ОА-ячейку, что освещение исследуемого образца через сапфировое окно могло осуществляться снизу, сверху или сбоку. Особенность получения ОА-спектров образцов, способных осаждаться (к ним относится и кровь), заключается в том, что поскольку концентрация частиц (в которых происходит поглощение света) неодинакова по

глубине и меняется со временем, то амплитуда и фаза сигнала будут зависеть от направления освещения кюветы и меняться с течением времени, что позволяет исследовать процесс осаждения. При освещении кюветы сверху или снизу амплитуда и фаза ОА-сигнала сильно изменялись во времени, а при освещении сбоку оказались

7.4. Области применения оптико-калориметрических методов в биологии и медицине 357

сравнительно стабильными, что позволило получить ОА-спектры цельной крови, в том числе и спектры крови с добавлением токсических веществ. По ним можно судить о химических реакциях в образцах. Многие исследователи указывают на легко регистрируемые изменения в ОА-спектре крови, вызванные разной степенью насыщения ее кислородом. С помощью ОА-спектроскопии цельной крови и выделенных из нее эритроцитов показана возможность диагностики лейкемии (рис. 7.16) и ряда сердечно-сосудистых заболеваний [1302].

Разработаны практические схемы ОА- и ОТ-спектроскопии для гематологии, позволяющие контролировать степень оксигенации цельной крови [1338], процесс ее седиментации и характер патологий. Развиваются также методы ОА-контроля им-

мунного отклика биологических компонентов в клеточных суспензиях на специфические белковые пробы, служащие индикатором ряда патологий, например злокачественных новообразований в тканях кост-

ного мозга или ревматоидных заболеваний. Первые исследования в дерматологии

ОА-методом были выполнены в основном на вырезанных эпидермальных образцах тка-

ней человека и животных [5, 329]. Была обнаружена полоса поглощения протеинов (λ = 280–290 нм), а также получена зависимость амплитуды ОА-сигнала от содержания воды в образце. Интересны эксперименты по контролю медикаментов в тканях,

изучению их действия на кожу, определению скорости их диффузии. Исследования, в частности, показали, что скорость диффузии тетрациклина в коже ладони в 25 раз меньше скорости диффузии воды. Удалось зафиксировать изменения гидратации тонкого рогового слоя (9–13 мкм). Спектр снимается в УФ-области. Увеличение влажности приводит к снижению спектральной кривой за счет изменения свойств рогового слоя (теплопроводности и удельной теплоемкости). Для определения влажности можно ограничиться только одной длиной волны, например в максимуме поглощения на λ = 280 нм. Глубинное профилирование содержания воды в эпидермисе осуществляют путем изменения частоты модуляции.

Другой подход для определения содержания воды в тканях связан с использованием спектра поглощения воды в ближней ИК-области. Такая методика была апробирована на примере синтетического белка и молочного порошка с помощью ОА-ИК-спектрометра. Оказалось возможным определять наличие свободной и связанной воды при измерении поглощения на λ = 1,9; 2,2 или 1,4 мкм. Такая методика определения влажности отличается быстротой проведения анализа, нечувствительностью к изменениям массы образца и размеров частиц.

Главная трудность ОА-измерений на коже in vivo состоит в чувствительности микрофона к движениям тела (мускульная активность, ток крови, нервные импульсы). Для преодоления этих трудностей служит спектрометр с дифференциальной ОА-ячейкой с открытым концом для измерения in situ (см. рис. 7.12, д). Свет на образец поступает по световоду, поэтому можно прикреплять ячейку к исследуемому образцу в любом удобном месте. Получены ОА-спектры кожи брюшной полости крысы, кожи предплечья человека, обработанной мербромином. Эксперименты показали, что ОА-сигналы могут быть зарегистрированы с удовлетворительным отношением сигнал/шум. Измерения глубины проникновения светозащитных препаратов в кожу

7.4. Области применения оптико-калориметрических методов в биологии и медицине 359

температуры биоткани и ее коагуляции в процессе лазерной фототермической терапии или ее замораживания и размораживания [1320, 1330, 1331, 1336, 1337]. Контроль процесса абляции ткани (дентина зуба) можно осуществлять и с помощью метода оптотермической радиометрии [1309].

Вряде работ [1290, 1305, 1316] изучаются возможности применения сильных ОА-эффектов в биологии и медицине. В частности, дана классификация сильных ОА-эффектов с точки зрения их применения для деструкции и локальной диагностики биотканей (ОА-«квазигидростатические» эффекты в открытом пространстве

сформированием ударных волн, вызванных оптическим пробоем; «механический» ОА-эффект, который включает механическое движение вещества, а также высокоэффективное ОА-преобразование для ультразвуковой диагностики). Исследуются процессы деструкции желчных камней с помощью высокоэнергетического (до 12 Дж) излучения АИГ:Nd-лазера с λ = 1060 нм, которое доставлялось в область взаимодействия волоконным световодом.

При анализе возможности снижения опасности разрушения окружающих биотканей были проведены исследования влияния сфокусированного излучения АИГ:Nd-ла-

зера с τи = 10 нс и 10 пс с соответствующей энергией 80 и 50 мДж на клеточные структуры клеток типа луковичной кожицы [1305]. Оказалось, что при возникающем вблизи области пробоя давлении порядка 2 · 103 атм не обнаруживается деструкция клеточных структур (также и тканей), что можно связать с близостью акустических свойств клеток и воды. Отметим, что регистрация давления внутри исследуемых тканей была осуществлена с помощью лазерного шлирен-метода.

Вработе [1290] рассматривался процесс фрагментации мочевых и желчных камней с помощью видимого импульсного излучения микросекундной длительности. Для мониторинга процесса абляции камней и выявления роли воды в формировании волн напряжения использовались дефлекционный (см. рис. 7.7) и пьезоэлектрический пленочный приемники акустических волн. Оказалось, что в воде эффективность фрагментации камней в 10 раз выше за счет иммерсионных свойств воды по отношению к волнам напряжения, проходящим через камень в период лазерной абляции.

Значительные возможности в изучении оптических и теплофизических параметров биотканей имеет метод импульсной оптико-термической радиометрии [1279, 1280, 1282–1284, 1287]. Данный метод также оказался достаточно эффектив-

7.4. Области применения оптико-калориметрических методов в биологии и медицине

Рис. 7.22. Акустический преобразователь: 1 — биоткань, 2 — лазерный пучок, 3 — облучаемый объем, 4 — акустическая волна, 5 — акустический проводник, 6 — покрытие, согласующее акустические импедансы, 7 — акустический LiNbO3-детектор, 8 — электрод, 9 — к цифровому осциллографу

давления по глубине образца для z > µ−d 1 определяется соотношением [1310]

= βva2/cp; k — коэффициент, учитывающий эффект обратного рассеяния, который увеличивает освещенность верхних слоев ткани; µd — диффузионный коэффициент (см. (2.7)); E0 — плотность энергии лазерного импульса на поверхности образца (Дж/см2), остальные параметры представлены в (7.5). Для оптически толстых об-

разцов

k ≈ (1 + 7,1Rd),

где Rd — коэффициент диффузного отражения.

Соотношение (7.21) справедливо для случая, когда процесс нагрева существенно быстрее скорости расширения среды. Параметр является зависящим от температуры безразмерным параметром, пропорциональным части тепловой энергии, преобразованной в механическое давление. Для воды

= 0,0043 + 0,0053T ,

где T — температура, ◦C; для T = 37◦С ≈ 0,2.

В работе [1310] представлены результаты измерений оптических параметров для ряда биотканей человека и животных, выполненные с помощью ОА-спектрометра, показанного на рис. 7.21. В дополнение к данным табл. 3.1 приведем здесь лишь данные для атеросклеротической аорты человека: µa = 16,5; 3,53 и 0,15 см−1, а µ′s = 72,1; 36,5 и 4,85 см−1, соответственно на длинах волн 355, 532 и 1064 нм, при этом толщина исследуемых образцов была соответственно — 3, 7 и 12 мм, а среднеквадратичная ошибка измерений оценивалась как 10, 15 и 50 %.