Амплификация
Амплификация в молекулярной биологии – увеличение числа копий ДНК. В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК. В искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции (рис. 2).
Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле после соответствующего окрашивания.
Рис. 2. Схематическое изображение первого цикла ПЦР.
(1) - Денатурация при 94–96 °C; (2) - Отжиг при 68 °C ; (3) - Элонгация при 72 °C (P-полимераза); (4) - Закончен первый цикл.
Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе в геометрической прогрессии. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя.
Факторы, влияющие на эффективность амплификации
Структура и концентрация праймеров.
Структура матрицы.
GC-состав.
Концентрация магния.
Активность ДНК-полимеразы.
Концентрация ДНК искомого инфекционного агента.
Неэффективный способ обработки биоматериала.
Одним из перспективных направлений в модификации амплификационного этапа является разработка систем, реализующих "твердофазную" амплификацию. В таких системах один из олигонуклеотидных праймеров ковалентно иммобилизован на специально модифицированном слое пластика пробирки. Получаемые в ходе ПЦР ампликоны также остаются иммобилизованными на твердой фазе, что исключает риск контаминаций и упрощает последующую процедуру их детекции. В последнее время большое внимание ученых обращено на дизайн амплификационных смесей, благодаря чему стало возможно применение мультипраймерной ПЦР, что увеличивает производительность и дает возможность выявления большего количества патогенных микроорганизмов или иных определяемых признаков, и в перспективе будет иметь большое значение при использовании в современных устройствах регистрации ДНК-биочипах.
Использование «горячего старта» при постановке пцр
Для оптимизации ПЦР, для повышения эффективности прохождения реакций, уменьшения риска образования неспецифических продуктов реакции амплификации используют подход, получивший название «горячий старт» (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием GC-пар и рассчитывается по следующей формуле: Tm =[(A+T) x 2] + [(G + C) х 4]. В зависимости от GC -состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm), при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.