- •Пцр - анализ в клинической лаборатории
- •Р е ц е н з е н т ы
- •К о л л е к т и в а в т о р о в
- •Оглавление
- •Введение
- •История открытия и разработка метода пцр
- •Механизм полимеразной цепной реакции
- •Праймеры
- •Полимераза
- •Пробоподготовка (выделение днк/рнк)
- •Амплификация
- •Факторы, влияющие на эффективность амплификации
- •Использование «горячего старта» при постановке пцр
- •Приборное обеспечение
- •Регистрация результатов
- •Возможности лабораторной диагностики инфекционных болезней
- •Преимущества пцр перед другими методами клинической лабораторной диагностики
- •Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
- •Специфичность
- •Чувствительность
- •Актуальность ответа (быстрота получения результата анализа)
- •Возможность экспертизы
- •Исследуемый биологический материал
- •Локализация возбудителей
- •Правила забора материала и транспортировки клинического материала для пцр-диагностики
- •Кровь, плазма, сыворотка
- •Соскоб с эпителиальных клеток для выявления днк возбудителей инфекций, передающихся половым путем
- •Факторы, влияющие на эффективность выявления урогенитальных патогенных микроорганизмов с помощью нк
- •Правила подготовки больного для пцр-диагностики урогенитальных инфекций
- •Мазок с конъюнктивы, слизистой зева и дыхательных путей
- •Гепатит а (hаv), е (hеv)
- •Гепатит в (hвv)
- •Гепатит d (вгd)
- •Гепатит с (hcv)
- •Использование пцр в пульмонологии и фтизиатрии
- •Применение пцр в урогинекологической практике
- •Основные клинические синдромы и урогенитальные инфекции
- •Генитальный герпес вызывает вирусы простого герпеса I и II типов
- •Криминология
- •Установление отцовства
- •Персонализированная медицина
- •Клонирование генов
- •Онкология
- •Применение пцр в практике службы крови
- •Управление качеством пцр-исследований
- •Преаналитический этап
- •Аналитический этап
- •Контроль качества пцр-исследований
- •Контроль реакции амплификации
- •Внутренний контроль вко
- •Проблема контаминации
- •Действия при возникновении контаминации нуклеиновыми кислотами
- •Постаналитический этап
- •Заключение
- •Вопросы для самопроверки
- •Ответы на вопросы для самопроверки
- •Список литературы
- •Приложение
- •Возможности пцр-диагностики в гуз иоккдц
- •Комплекс исследований на заболевания,
- •Передающиеся половым путем (зппп), 2ж3001
- •Хламидиоз, 2ж3002
- •Туберкулез, 2жз003
- •Гепатит с, 2ж3004
- •Микоплазма гоминис, 2ж3005
- •Трихомониаз, 2ж3006
- •Гепатит в, 2ж3007
- •Уреаплазма, 2ж3009
- •Папиллома (впч с определением онкогенности), 2ж3010
- •Гонорея, 2ж3011
- •Гепатит с количественный, 2ж3012
- •Генотипирование вируса гепатита с, 2ж3013
- •Микоплазма гениталиум, 2ж3015
- •Цмв, 2ж3019
- •Вирус Эпштейна-Барр, 2ж3020
- •Вирус герпеса I-го и II-го типов, 2ж3021
- •Вирус герпеса 6-го типа, 2ж3022
- •Токсоплазмы гондии, 2ж3023
- •Энтеровирус, 2ж3027
- •Гепатит в количественный, 2ж3031
- •Пцр - анализ в клинической лаборатории
- •664079, Г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100, к. 302.
Аналитический этап
Аналитический этап – первый этап, который осуществляется непосредственно в лаборатории.
Для качественного выполнения анализов необходимо современное передовое оборудование, квалифицированные специалисты, набор реагентов, имеющих высокую диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность. Для контролирования качества выполняемых исследований проводится внутрилабораторный и внешний контроль качества, контроль оценки качества в ФСВОК – федеральной системе внешней оценки качества (Россия) и EQAS (США) - Международной системе оценки качества.
Применение метода ПЦР требует строгого соблюдения правил в организации работы и проведении всех этапов анализа.
Исследования материала от больного методом ПЦР проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с патогенными биологическими агентами (ПБА) III–IV групп патогенности.
Исследования разделяются на три этапа и проводятся в трех изолированных помещениях (зонах) согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции».
Проведение ПЦР-диагностики инфекций связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ампликонов из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфической ДНК из образцов на этапе пробоподготовки приводит к появлению ложноположительных результатов.
Контроль качества пцр-исследований
Программы контроля качества, действующие в лабораториях, не обеспечивают 100%-ной гарантии от ошибок, в них содержатся тщательно разработанные требования по квалификации персонала, текущему обслуживанию и контролю состояния оборудования, а также другим стандартным операциям.
Помимо внутреннего, за лабораториями налажен внешний контроль со стороны федеральных и региональных органов контроля, а также профессиональных сертифицирующих организаций. Основные мероприятия, предусмотренные на каждом из этих трех этапов работы, представлены в таблицах ниже. Иногда, если результаты исследования не соответствуют другим данным, а состояние пациента нетяжелое и не требует экстренной помощи, врач может применить выжидательную тактику. В других случаях врач может повторить некоторые лабораторные исследования, чтобы убедиться в их соответствии исходному результату, либо в том, что результаты самостоятельно нормализовались.
Подтверждение информации – путем повторения исследований, контрольных исследований через некоторое время, получения второго или даже третьего мнения – особенно важно в случаях, когда предполагается тяжелое заболевание или планируется применение сложного метода лечения. Так, ставки очень высоки при подозрении на рак, СПИД, порок развития плода. Если предполагается проведение крупной операции, применение токсичного метода лечения, либо терапия может оказаться очень тяжелой или приводящей к необратимым осложнениям, в интересах пациента провести проверку результатов обследования, даже в случаях, когда время терять нельзя.
Как и в других случаях, врач должен тщательно взвесить также данные непосредственного обследования и анамнеза, чтобы понять, поддерживают ли они предполагаемый диагноз или противоречат ему.
Рис. 10. Бланк ФСВОК с результатом оценки выявления
вирусов гепатита С методом ПЦР.
Обязательным условием для успешного применения методов молекулярной биологии является понимание возможных ошибок на всех этапах анализа, их устранение или сведение к минимуму. Для этого при проведении ПЦР-исследований наряду с внутрилабораторным контролем качества проводится и внешняя оценка качества (рис. 10), ФСВОК (Россия).
Контроль качества исследований:
Осуществляется постоянно путем включения в каждую постановку ПЦР-реакции положительного, отрицательного и бланк-контролей (контроль качества выделения ДНК).
Периодически применяются собственные лабораторные положительные и отрицательные контроли, охарактеризованные и другими методами диагностики данной инфекции.
Применяются зашифрованные контрольные образцы ФСВОК (Федеральный стандарт).
Проверяется чувствительность и специфичность каждой новой серии диагностических наборов методом ПЦР, для стандартизации работы ПЦР тест-систем используются референс-панели.
Преимущество имеют ПЦР-наборы, укомплектованные внутренним контролем качества.
Отсутствие внутреннего контроля при рутинном клиническом ПЦР-исследовании приводит к увеличению ложноотрицательных результатов – в случае присутствия ингибиторов реакции.