Управление качеством пцр-исследований

Применительно к медицинским лабораториям понятие «качество» можно сформулировать следующим образом: качество лабораторных исследований – это правильно и своевременно назначенные тесты для нуждающегося в них пациента, выполненные на достаточном аналитическом уровне с необходимой информацией для их интерпретации.

ПЦР – высокотехнологический метод, требующий соблюдения строгих правил оснащения и организации работ в ПЦР-лабораториях, которые обобщены и сформулированы в нормативных документах. На основании этих документов проводится лицензирование деятельности лабораторий, занимающихся генодиагностикой.

ДОКУМЕНТЫ, РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ

ГЕНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ

Основные документы, регламентирующие проведение ПЦР-анализа в КДЛ следующие:

1. Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологи­ческих учреждений системы Министерства здравоохранения СССР № 2455-81.

2. Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Постановление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28 января 2008 г. “Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил” № 1.3.2322-08.

3. Методические рекомендации, разработанные ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А. Тарасевича «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦР-генодиагностической лаборатории».

4. Методические указания МУ 1.3.1888-04 по организации работы при исследованиях методом ПЦР-материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности.

5. Методические рекомендации по забору, транспортировке, хранению клинического материала для ПЦР-лаборатории. МЗ РФ ЦНИИЭ, 2005 г.

6. Методические указания по применению дезинфицирующего средства «ДП-2Т». МЗ РФ, 2001 г.

7. Работа с возбудителями туберкулеза и материалом, подозрительным на инфицированность возбудителем туберкулеза, осуществляется в соответствии с приказом МЗ РФ от 21.03.2003 №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПЦР-ЛАБОРАТОРИЙ

Согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения» и методическим указаниям, на этапе создания лаборатории для обеспечения качества ПЦР-исследований необходимы продуманные инженерно-планировочные решения, следует четко разграничивать ПЦР-лабораторию на "зоны" (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-реакции.

Руководствуясь этими документами, лаборатория молекулярной биологии ИДЦ разделена на следующие зоны (комнаты):

1. Пре-ПЦР-помещение 1 (площадь 3,6 кв. м), которая предназначена для первичной обработки клинических образцов. Обработка клинических образцов производится в настольном боксе с ультрафиолетовыми лампами с вытяжной вентиляцией. После первичной обработки клинический материал инактивируется с лизирующим буфером, обеспечивающим полное обеззараживание материала, полное разрушение клеточных мембран и лизис клеток, не повреждая ДНК и не ингибируя ПЦР. Обеззараженные пробы переносятся в закрытых пластмассовых емкостях в пре-ПЦР-помещение 2. Остатки клинического материала, использованная посуда и другие загрязненные ДНК/РНК материалы на этапах первичной обработки собираются в закрывающиеся емкости, предназначенные для транспортировки, и переносятся в автоклавную. В автоклавной для создания асептических условий приточно-вытяжная система оснащена фильтрами тонкой фиксации.

2. Пре-ПЦР-помещение 2 (площадь 34,5 кв. м) – с помощью лабораторной информационной системы (ЛИС) производится компьютерная сортировка поступивших проб на ПЦР-исследования, составление протоколов, выдача результатов лабораторных исследований. В кабинете имеется рабочая зона для выделения нуклеиновых кислот и боксированная зона для приготовления ПЦР-смеси, постановки ПЦР (внесение в подготовленные с ПЦР-смесью пробирки выделенных препаратов ДНК, РНК или кДНК). Настольные боксы оснащены ультрафиолетовыми лампами. По окончании работы все объекты-пробы убираются в холодильники. Клинические образцы и пробы, содержащие ДНК/РНК, хранятся отдельно от реагентов. На окнах предусмотрены жалюзи для защиты рабочих столов от попадания солнечного света. В кабинете установлен кондиционер в соответствии с санитарными правилами.

3. Чистая комната (площадь 2,3 кв.м.) – для приготовления реакционных смесей.

4. Пост-ПЦР-помещение. Здесь проводится электрофоретический анализ продуктов амплификации и документирование результатов с помощью видеосистемы. Комната находится в отдаленном от основных зон помещении, чтобы исключить контаминацию через движение воздуха из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения. Работа ведется в одном направлении от пре-ПЦР-помещения к пост-ПЦР-помещению. Работа производится в одноразовой рабочей одежде. После проведения и обработки фотоизображений электрофорезов ПЦР - исследований и их архивации пробирки с продуктами ПЦР, использованные наконечники для автоматических пипеток, одноразовая одежда, перчатки и другие загрязненные ДНК-ампликонами материалы обрабатываются реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1N HCI, гипохлорид Nа, 10% хлорная известь, 0,2%-ный раствор ДП-2Т) с экспозицией 120 мин. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТ В ЛАБОРАТОРИИ

Рабочие помещения должны быть оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м³. Лампы должны быть расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение необходимо проводить в течение одного часа до начала работы и в течение одного часа после окончания работы.

Все кабинеты лаборатории оснащены в полном объеме емкостями для дезинфицирующих средств.

Работа должна проводиться в лабораторной одежде. В пост-ПЦР-помещении используется разовая рабочая одежда.

В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях должны работать разные сотрудники, чтобы избежать переноса продуктов амплификации на одежде и кожных покровах на этап пробоподготовки и тем самым исключить ложноположительные результаты исследований.

Каждое помещение и каждый сотрудник лаборатории имеет свой набор реактивов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Пробирки и наконечники для автоматических пипеток при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку используются однократно. Наконечники используются только с аэрозольным барьером и обязательной сменой при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации.

Во время выполнения любого вида работ с ПБА запрещается оставлять рабочее место; сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания.

Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в "чистой" зоне лаборатории с применением моющих средств, в "заразной" зоне – с применением дезинфектантов.

В конце работы обработка рабочих мест производится дезрастворами в соответствии с требованиями действующих нормативных документов, с последующей протиркой влажными одноразовыми салфетками для снятия остатков дезинфицирующего средства.

Остатки ПБА, использованная посуда, твердые отходы из "заразной" зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или дезинфицироваться на месте. Методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от ПБА и характера обеззараживаемого материала. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещается.

Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях.

По окончании работ медицинский персонал должен обработать руки дезинфицирующим раствором или 70% спиртом с последующим мытьем с мылом. Допускается использование кожных антисептиков в соответствии с инструкциями по применению.

Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места необходимо в каждом помещении иметь ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы (см. ниже).

Следует отметить еще одну особенность, затрудняющую исследования ДНК и РНК, это их высокая чувствительность к нуклеазам - ферментам деградации РНК и ДНК, которые могут обнаруживаться практически везде: на кожных покровах, на предметах лабораторного оборудования, реагентах, пластике. Поэтому пластик, используемый при работе с нуклеиновыми кислотами, сертифицирован на отсутствие РНКазной и ДНКазной активности. Кроме этого, пластиковые пробирки для амплификаторов должны иметь однородные тонкие стенки (для улучшения теплопроводности и сокращения времени циклов амплификации).

ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА В ХОДЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе ПЦР-исследования, как любого лабораторного исследования, можно выделить три этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический.

1. Преаналитический этап включает в себя назначение врачом необходимых тестов, взятие материала, его центрифугирование и транспортировку образца в лабораторию, сортировку и аликвотирование образцов в лаборатории.

2. Аналитический – пробоподготовку и исследование образца в лаборатории.

3. Постаналитический – интерпретацию результатов анализа специалистом лабораторной диагностики, постановку диагноза и назначение лечения пациенту.

Надежность результатов исследования обеспечивается качеством его проведения на каждом из этапов: назначение исследования —> получение материала —> проведение исследования —> отчет о результатах исследования.

В настоящее время ПЦР-диагностика быстро развивается, что связано с внедрением новых технологий и обновлением приборного парка. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, благодаря этому количество лабораторных ошибок непосредственно во время анализа минимально. Кроме того, существует достаточно возможностей для внутри - и межлабораторного контроля качества, которые реально используются в практике ПЦР – лабораторий. При этом преаналитический этап в наименьшей мере находится под контролем лаборатории, т.к. значительная его часть проводится сотрудниками других подразделений ЛПУ. Так, причиной ошибочного диагноза, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа, могут быть: неправильная подготовка больного, нарушения процедуры взятия биологического материала у пациента, упущения при доставке материала в лабораторию, халатность или недостаточные знания при хранении и обработке проб.