Действия при возникновении контаминации нуклеиновыми кислотами

1. Сотрудников, проводящих деконтаминацию, обеспечивают одноразовыми халатами, тапочками, перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления моющих и дезинфицирующих растворов.

2. Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в ней сотрудники.

3. Утилизируют все находящиеся в «контаминированной» зоне реактивы.

4. Утилизируют исследуемые материалы на всех промежуточных стадиях обработки.

5. Проводят обработку паром под давлением всей спецодежды «контаминированной» зоны.

6. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.

7. Обработку проводят от участка к участку последовательно, каждый участок обрабатывают отдельной ветошью.

8. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляют ветошью, смоченной водой.

9. На поверхность наносят на 30 минут дезинфицирующий раствор 0,2% ДП-2Т или аналогичный ему, разрешенный к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

10. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение одного часа.

11. Дезинфекцию дезрастворами с обработкой помещения ультрафиолетом повторяют еще раз.

12. Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

13. По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностику которых осуществляют в данной лаборатории.

14. Для проведения смывов стерильный зонд смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере, после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и т.п.

15. В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР-анализа обработку повторяют.

16. Загрязненный расходный материал утилизируют.

17. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

18. Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.

Постаналитический этап

Все результаты, выходящие за пределы референсных значений, просматриваются врачом-лаборантом или врачом-аналитиком. Результаты, вызывающие подозрение или не укладывающиеся в какую-либо клиническую картину, просматриваются, и в случае необходимости принимаются решения о перестановке анализа или выдаче результата с сопроводительной записью. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа (табл. 6).

Таблица 6

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики

Характер ошибки	Причина ошибки	Следствие ошибки	Возможность лабораторного контроля ошибки	Способы предотвращения ошибки
Контаминация пробы на стадии забора материала	Использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНК	Ложноположительный результат	Невозможен	Использование разового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медицинского персонала
Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР	Проба содержит примеси ингибиторов ПЦР. Сильными ингибиторами являются гемоглобин, гепарин	Ложноотрицательный результат	Осуществляется при использовании тест-систем с внутренним контролем	Использование разового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала
Забор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.	Несоблюдение правил забора материала (вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь)	Ложноотрицательный результат	В некоторых случаях возможен при визуальном контроле	Соблюдение правил забора материала; использование специальных одноразовых щеточек-зондов
Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы	Несоблюдение правил транспортировки и хранения проб	Ложноотрицательный результат	Невозможен	Соблюдение правил транспортировки и хранения проб
Потери ДНК во время пробоподготовки	Несоблюдение инструкции выделения ДНК; использование некачественных реактивов	Ложноотрицательный результат	Возможен при проведении положительного образца через все стадии пробоподготовки	Соблюдение инструкции выделения ДНК; использование качественных реактивов
Контаминация в отдельных пробах	Нарушение правил работы в ПЦР - лаборатории; использование одного наконечника при обработке разных проб; при внесении реагентов наконечник касается стенок пробирки; загрязнение дозатора	Ложноположительный результат	Возможен при постановке параллельных проб	Соблюдение правил работы в ПЦР - лаборатории; инструкции выделения ДНК и постановки ПЦР; использование наконечников с фильтрами
Тотальная контаминация	Загрязнение реагентов, дозаторов “положительной” ДНК	Ложноположительный результат	Осуществляется при постановке отрицательного контроля	То же

Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, т.к. именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Как показывает практика, при соблюдении правил работы и выполнении требований инструкций во время постановки ПЦР вероятность ошибок невысока.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа. Рассмотрим случай, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат, а ИФА выявляет противохламидийные антитела. Причиной подобного расхождения могут быть:

• “иммунологический след” – остаточный уровень IgG после ранее перенесенной хламидийной инфекции. У некоторых людей повышенный уровень антител может сохраняться многие месяцы и годы после полного выздоровления, что связано с индивидуальными особенностями иммунной системы;

• при проведении ИФА использовалась родоспецифическая тест-система, выявляющая все виды хламидий, в том числе респираторные: Ch. pneumonia, Ch. pecorum, Ch. psitaci, а при проведении ПЦР - анализа – видоспецифическая на Ch. trachomatis. В случае хламидийной инфекции, вызванной Ch. pneumonia, результат ИФА будет положительным, а результат ПЦР-анализа – отрицательным;

• материал для ПЦР-анализа получен не из места локализации инфекционного агента. Например, при хроническом сальпингите хламидии могут быть не обнаружены в области шейки матки, а наличие инфекционного процесса будет сопровождаться выработкой антител. При туберкулёзе половых органов поражается эндометрий матки. Поэтому "привычное" для гинеколога взятие влагалищного мазка может привести к ложноотрицательному результату. При туберкулёзе данной локализации следует исследовать материал, полученный из полости матки, либо менструальную кровь.

Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. Это возможно при хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией. Так, при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр противохламидийных антител, не превышающий критического уровня. При первичной инфекции следует также учитывать серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания, антител еще нет. Для урогенитальных инфекций этот период может составлять до двух недель.

Мировые руководства и стандарты не рекомендуют постановку диагноза «хламидиоз» по наличию антител IgA, IgM, IgG. Также не рекомендовано использовать определение антител для установления излеченности хламидиоза. Для диагностики хламидиоза, трихомониаза, микоплазмоза многолетним клиническим опытом разработаны и опробованы «классические» лабораторные методы – микробиологические (исследование мазка и посев на питательные среды), иммунологические (индикация методом ПИФ). Но под воздействием лечения морфологические и антигенные свойства возбудителей урогенитальных инфекций изменяются, и в этих случаях ПЦР-метод остается практически единственным, способным оценить результаты проведенной терапии урогенитальных инфекций.

Взаимодействие лабораторной службы и врачебного персонала является необходимым условием эффективной диагностики. Назначение тех или иных диагностических исследований целиком и полностью зависит от лечащих врачей. Стремительное развитие диагностической медицины приводит к тому, что клиницисты не могут в полной мере оценить возможности современных технологий. Часто недостаточная осведомленность или невозможность назначить нужное исследование, неправильный забор пробы приводят к тому, что уже на первом этапе допускаются ошибки, снижающие результативность использования дорогих и высокоинформативных технологий. В первую очередь необходимо отметить комплексность современной лабораторной диагностики. Сегодня вряд ли можно говорить о том, что какой-то из методов, применяемый изолированно, способен дать объективные и достоверные результаты. На начальном этапе принятия решения о подборе необходимого комплекса диагностических мер требуется ставить вопрос о разумном сочетании различных – как новейших, так и хорошо зарекомендовавших себя традиционных методов исследования с целью верификации присутствия инфекционного агента у пациента. Исключительную важность имеет также доказательность участия инфекционного агента именно в том патологическом процессе, который наблюдают клиницисты. Проблема заключается в том, что многие инфекционные агенты, с которыми приходится сталкиваться в ежедневной практике, относятся к так называемой латентной, или оппортунистической, группе. Выявление таких агентов не всегда является свидетельством их участия в патологическом процессе. Иногда инфекционный агент может быть обнаружен, однако его участие в воспалительном процессе оказывается минимальным либо вообще отсутствует, поскольку в данном случае он является сапрофитной флорой. Это касается многих как вирусных, так и бактериальных инфекций. Для того чтобы назначать этиологическое, а не синдромальное лечение, необходимо проводить мультифакторное исследование, стремясь точно определить роль того или иного патогена в конкретной клинической картине.

Использование ПЦР уже на поликлиническом этапе позволяет оперативно выявить больных пациентов и сразу после получения положительного результата анализа, в течение одних–двух суток с момента обращения, назначить антибактериальную терапию.