Практическое занятие №3 Лабораторный практикум

ТЕМА: Ферменты. строение. Общие свойства ферментов

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ:

1. Знать химическую природу, строение, свойства простых и сложных ферментов.

2. Знать принципы качественного определения активности ферментов в биологических жидкостях, тканях или их экстрактах и научиться методам обнаружения в слюне фермента -амилазы.

1. Исследовать зависимость ферментативной активности от t и pН среды на примере реакции, катализируемой -амилазой.

2. Уметь анализировать полученные результаты, сделать правильное заключение об оpt t и pН среды для работы фермента и уметь объяснить причины различной активности - амилазы в условиях разного t режима и pН среды.

Иметь представление о возможности использования знаний о свойствах ферментов в медицинской практике.

Базисные знания

• Из курса биоорганической химии студенты должны знать: простые и сложные белки;

• сведения о витаминах;

• понятие о ферментах;

• свойства неорганических и органических катализаторов;

• принципы качественного обнаружения активности ферментов.

Учебная карта занятия Вопросы для подготовки к занятию

1. Химическая природа ферментов. Проферменты (зимогены).

2. Кофакторы ферментов: химическая природа, классификация, роль витаминов в построении кофакторов и их коферментная функция.

3. Коферменты и простетические группы.

4. Структурно-функциональная организация ферментных белков: активный центр, его свойства. Контактный и каталитический участки активного центра ферментов.

5. Регуляторные (аллостерические) центры ферментов. Аллостерические модуляторы ферментов. Зависимость активности ферментов от конформации белков.

6. Представление об аллостерических активаторах и ингибиторах ферментов. Биологическое и медицинское значение активаторов и ингибиторов ферментов.

7. Общие свойства ферментов. Зависимость активности ферментов от реакции среды и температуры: биологическое и медицинское значение этих свойств ферментов.

8. Общие принципы механизма действия ферментов.

9. Принципы качественного определения активности ферментов

10. Номенклатура и классификация ферменто Принципы качественного определения активности ферментов.

11. Номенклатура и классификация ферментов.

Практическая часть Специфичность действия ферментов

Специфичность действия ферментов можно наблюдать на примере амилазы слюны, субстратом для которой является крахмал или гликоген.

Амилаза расщепляет крахмал через стадию декстринов до редуцирующего дисахарида – мальтозы.

О действии фермента можно судить или по исчезновению (расщеплению) субстрата или по образованию конечных продуктов его расщепления.

Принцип метода: -амилаза слюны катализирует гидролиз -1-4 гликозидных связей в крахмале и гликогене, что приводит к расщеплению (убыли) субстрата и появлению продуктов гидролиза – декстринов и дисахарида мальтозы. Определяя убыль субстрата (крахмала) с помощью реакции с реактивом Люголя (раствор йода в KI), судят о наличии в слюне фермента амилазы. Крахмал открывается пробой Люголя. Как известно, крахмал со свободным иодом дает синее окрашивание.

Конечные продукты расщепления крахмала можно обнаружить с помощью редуцирующих проб, например, пробой Фелинга. Реакция основана на способности углеводов восстанавливать металлы. При нагревании голубой гидрат окиси меди восстанавливается углеводом сначала в гидрат закиси меди желтого цвета, а при дальнейшем нагревании в закись меди кирпично-красного цвета.

Химизм реакции:

-амилаза -амилаза

( С₆ Н₁₀ О₅)_n +н₂о декстрины +н₂о _n(С₁₂ Н₂₂ О₁₁)

крахмал мальтоза

Ход работы:

В пробирку 1 отмерить 2 мл 0,5 раствора крахмала, в пробирку 2 – 2 мл 2% раствора сахарозы. В обе пробирки добавить по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат или водяную баню при температуре 38С на 10 минут. После этого с содержимым каждой пробирки проделать пробы Фелинга и Люголя. Для контроля провести с 0,5 % раствором крахмала пробу Люголя и пробу Фелинга с 2% раствором сахарозы.

N пробирки	Источник фермента	Субстрат	Реакция с раствором Люголя (окраска)	Проба Фелинга	Вывод