Практическое занятие № 2

(Лабораторный практикум)

ТЕМА: Физико-химические свойства белков Растворимость, ионизация, гидратация и виды осаждения белков.

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ: Изучить основные свойства белка: растворимость, гидратация, ионизация белков в растворе, осаждение белков из растворов (обратимое и необратимое), познакомиться с методами выделения белков, освоить метод разделения белка - хроматографический

Базисные знания

Из курса биоорганической химии студенты должны знать:

- физико-химические свойства белков;

- уровни организации белковой молекулы

Из курса биофизики:

- устройство и работу ФЭК, а также порядок работы с ним.

Учебная карта Вопросы для подготовки к занятию

1. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация.

2. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрического заряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда. Понятие изоэлектрической точки белков.

3. Обратимое осаждение белков – высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс.

4. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны – класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающие формирование их нативной структуры.

5. Методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрация, ионообменная, афинная хроматография.

Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Применение.

Практическая часть занятия Высаливание белков сыворотки

Принцип метода: Высаливание белков сыворотки крови (NH₄)SО₄ может быть использовано для разделения альбуминов от глобулинов в связи с тем, что глобулины осаждаются при 50% насыщении, а альбумины при 100% насыщении (NH₄)SО_4.

Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора (NH₄)SО₄. Через 15 минут осадок отфильтровать и к фильтрату добавить сухого (NH₄)SО₄ до полного насыщения. Осадок через 10 минут отфильтровать. Для доказательства обратимости высаливания полученные осадки прямо на фильтрах смочить 2-3 мл дистиллированной воды. Отметить их растворение. С фильтратами проделать биуретовую пробу.

Результат:

Вывод:

Тепловая денатурация белков

Принцип метода. При нагревании глобулярных белков происходит их тепловая денатурация. При этом белки выпадают в осадок

Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл раствора белка, добавить 2-3 капли 5% раствора уксусной кислоты и нагреть до кипения.

Результат:

Вывод:

Осаждение белков органическими растворителями

Принцип метода. При длительном воздействии некоторых органических растворителей (спирт, ацетон и др.) на глобулярные белки происходит их десальватацияи денатурация.

Ход работы. К 0,5 мл раствора белка осторожно по стенке прилить 1-2 мл спирта. Отметить появление белого кольца на границе наслаивания.

Результат:

Вывод:

Осаждение белков органическими кислотами

Принцип метода. Ряд органических кислот вызывает денатурацию белков. Наиболее широко в различных биохимических исследованиях для осаждение белков применяются трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты (ССК). В медицине применяют для обнаружения белка в моче.

Ход работы. Налить в пробирку 1-2 мл раствора белка и добавит равный объем 5% ТХУ.

Результат:

Вывод:

Ход работы. К 0,5 -1 мл раствора белка добавить 5-6 капель 20 % ССК

Результат:

Вывод:

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Многие концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка. Осаждение белков азотной кислотой лежит в основе пробы Геллера, широко используемой в практике обнаружения белка в моче.

Ход работы. К 0,5 -1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наслоить равный объем раствора белка. На границе наслаивания отметить образование белого кольца.

Результат:

Вывод:

Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.

Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол; СН₃СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.

Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.

Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.

Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А

Rf.= ----

Б

Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.

Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашом, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.

На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего края с растворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.

Результат.

Вывод.