Практическое занятие № 16

(Лабораторный практикум)

ТЕМА: Внутриклеточное окисление белков. Превращения а/к по амино- карбокси-группе и углеводородному скелету.

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ: Изучить общие пути катаболизма аминокислот (превращения по аминогруппе, превращения по карбоксильной группе, превращения по углеродному скелету); узнать основные механизмы образования аммиака в организме, причины его токсичности и пути обезвреживания, уметь определять активность трансаминаз в крови, применять их оценку в будущей клинической практике

- Базисные знания

Из курса биоорганической химии студенты должны знать понятия

- трансаминирования,

- декарбоксилирования,

- восстановительного аминирования альфа-аминокислот.

Учебная карта занятия вопросы для подготовки к занятию:

1. Основные пути поступления и использования аминокислот в организме человека.

2. Общие пути превращения аминокислот. Катаболические превращения аминокислот по NН₂ группе, по СООН группе и по углеродному “скелету”.

3. Трансаминирование (переаминирование). Химизм процесса, характеристика трансаминаз, роль витамина В₆ в трансаминировании.

4. Аланиновая (АлАТ) и аспарагиновая (АсАТ) аминотрансферазы. Клиническое значение определения содержания трансаминаз в крови и тканях.

5. Биологическое значение реакций трансаминирования. Коллекторная функция -кетоглутарата в процессе трансаминирования.

6. Дезаминирование аминокислот. Виды дезаминирования. Окислительное (прямое) дезаминирование глутамата. Химизм и значение процесса, характеристика фермента.

7. Трансдезаминирование аминокислот (непрямое дезаминирование). Схема процесса. Роль -кетоглутарата, глутамата в этом процессе. Биологическое значение трансдезаминирования.

8. Судьба безазотистого остатка аминокислот (-кетокислот). Гликогенные и кетогенные аминокислоты. Связь обмена аминокислот с ЦТК.

9. Источники и основные пути образования аммиака.

10. Токсичность и пути обезвреживания NH₃:

а) восстановительное аминирование -кетоглутарата;

б) образование амидов (глутамина, аспарагина) и аланина - транспортных форм аммиака;

в) образование солей аммония (аммонигенез в почках); роль глутамина (аспарагина) в образовании солей аммония в почках и поддержании кислотно-основного состояния в организме.

г) биосинтез мочевины. Цикл Кребса-Хензелайта (орнитиновый цикл). Химизм процесса, роль аспартата в этом процессе.

12.Нарушение биосинтеза мочевины. Гипераммониемия. Врожденные ферментные нарушения цикла мочевинообразования (цитрулинемия и аргининемия).

Практическая часть Определение активности алт и аст

Образующаяся в результате переаминирования щавелевоуксусная кислота декарбоксилируется при помощи анилинцитрата и превращается в ПВК. Последнюю определяют в виде 2,4 динитрофенилгидразина. Поскольку реакционная смесь содержит -кетоглутаровыую кислоту, которая в этих же условиях образует соответствующий гидразон с 2,4 фенилгидразином, пробу экстрагируют толуолом. В толуол переходит только гидразон ПВК, а гидразон -кг остается в водном растворе. При добавлении к толуоловому экстракту спиртовой щелочи развивается стабильное красно-орнажевое окрашивание. Интенсивность которого пропорциональна концентрации ПВК,. Определяют колориметрически на ФЭКе.

Ход работы. В центрифужные пробирку внести по 0,5 мл субстратов для определения АСТ илиАЛТ, пробирки выдержать в термостате 4-5 минут при температуре 25С, затем добавить 0,5 мл сыворотки крови и перемешать.Пробы инкубировать в термостате 20 минут при 25С, после этого добавить 3 капли анилинцитрата, перемешать, оставить при комнатной температуре на 20 минут, в каждую пробирку затем внести по 0,5 мл 0,1% раствора 2,4 динитрофенилгидразина, перемешать, оставить на 5 мин. при комнатной температуре, после добавить насыщенного раствора толуола. Пробирки энергично встряхивают, центрифугируют при 2000 оборотах в тчение 5 минут. К 1,5 мл толуолового экстракта добвить 4,5 мл 2,..5% раствора спиртовой щелочи, перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 минут при комнатной температуре.

Параллельно проводят контрольную пробу, содержащую вместо сыворотки крови 0,5 мл дистиллированной воды.

Окраску опытной пробы колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах 10 мм против контрольной пробы.

Активность АСТ иАЛТ вычисляют при помощи калибровочных кривых

Результат:

Вывод:

ПРИЛОЖЕНИЕ

Среди множества веществ в организме особенно широко и разнообразно представлены белки. Нет других веществ с такими уникальными свойствами, позволяющими выполнять широкий спектр функций, причем таких, которые не могут быть выполнены никакими другими веществами организма человека. В этом смысле жизнь действительно зависит от тысяч различных белков. Вот почему белки являются незаменимой составной частью пищевого рациона и исключение их из пищи даже на короткий срок невозможно (для людей разного возраста). Это может привести к различным патологическим состояниям, быстро развивается белковая недостаточность (белковое голодание), последствием которой может быть –гипопротеинемия, снижение синтеза ферментов, гормонов и т.д. Недостаточность в белках в какой-то степени может наблюдаться у людей с особыми потребностями в питании (дети, беременные и кормящие матери, пожилые люди, перенесшие оперативные вмешательства, больные, выздоравливающие и т.д.).

При изучении белкового обмена важно знать, достаточно ли организм получает белков с пищей, а в связи с этим необходимо усвоить следующие понятия: норма белка в питании, пищевая ценность белка (соотношение заменимых и незаменимых аминокислот, содержание всех аминокислот), азотистый баланс (разница между поступлением азота в организм с пищей и выведение его с конечными продуктами обмена) и виды азотистого баланса (азотистое равновесие, положительный, отрицательный).

Источники белков для человека – пищевые продукты животного и растительного происхождения (молоко, рыба, мясо, яйцо, творог, соя, фасоль, горох и т.д.). Организм получает белки либо в нативном или в денатурированном виде, но проходить через клеточные мембраны они не могут, поэтому белки пищи никогда не поступают в состав тканей и органов без предварительного гидролиза (протеолиза) в желудочно-кишечном тракте.

Под действием протеолитических ферментов пищеварительных соков (желудочного, панкреатического, кишечного) белки расщепляются до свободных аминокислот (I этап обмена белков в организме)

Назначение этого процесса:

а) лишение белков видовой и тканевой специфичности;

б) обеспечение процесса всасывания, поступления в кровоток, затем в ткани;

в) возможность использования клетками организма в процессе метаболизма.

Поступившие в кровоток аминокислоты быстро поглощаются клетками печени, почек и др. и концентрация свободных АК в крови небольшая (~2,5 г во всем объеме крови), но и внутриклеточное содержание их также невелико. Принято считать, что в норме АК составляют так называемый сбалансированный внутриклеточный пул свободных аминокислот, который характеризует интенсивность процессов поступления и использования (расходования) аминокислот.

Все клетки, за исключением эритроцитов, используют АК прежде всего на анаболические процессы: для синтеза самых разнообразных белков и множества других веществ. И совсем незначительная часть АК подвергается процессам катаболизма (окисления). Последнее становится возможным лишь в 3 случаях:

1. если АК для синтетических процессов в данный момент клетками больше не используются;

2. если организм с пищей получает их больше, чем ему необходимо для белкового синтеза;

3. если организм оказался в особой ситуации дефицита основных энергетических субстратов (глюкозы, ТАГ), т.е. тогда, когда в качестве энергетического топлива вынужденно используются белки (сахарный диабет, голодание, раковые заболевания, состояние невесомости и др.).

Следует помнить, что аминокислоты не откладываются в запас и в организме нет какой-либо специальной формы хранения аминокислот, подобно гликогену или ТАГ.

Исходя из химического строения аминокислот процессы катаболизма можно условно разделить на следующие: а) по – NH₂ группе (трансаминирование, дезаминирование, трансдезаминирование); б) по – СООН группе (декарбоксилирование); в) по углеводородному скелету.

Более подробно следует остановиться на процессе трансаминирования аминокислот (переаминировании), в котором всегда участвуют -аминокислота (донор, поставщик NH₂ групы) и -кетокислота (акцептор -NH₂ групы) особенно -кетоглутаровая. В результате образуется новая аминокислота и соответствующая -кетокислота. Процесс катализируют ферменты - аминотрансферазы, простетической группой которых является фосфорный эфир витамина В₆ (фосфопиридоксаль). Особое внимание должно быть уделено двум ферментам - АлАТ и АсАТ, активность которых в норме достаточно высокая в различных тканях и, особенно, в печени и сердечной мышце, и низкая - в сыворотке крови. Их активность возрастает в крови при патологии печени (профзаболевания при отравлении различными ядами, циррозе, гепатите) – главным образом АлАТ и инфаркте миокарда – АсАТ, что очень важно для диагностики и оценки результатов лечения.

Исключительная роль в процессе трансаминирования принадлежит -кетоглутаровой и глутаминовой кислотам.

Смысл трансаминирования в его коллекторной (собирательной) функции, т.е. в том, что -NН₂ группы от разных аминокислот “собираются” в единственном соединении; в - глутаминовой кислоте, т.к. акцептором -NН_2-групп от большинства аминокислот является -кетоглутарат.

Таким образом, катаболизм многих аминокислот приводит в конечном итоге к одному единственному метаболиту.

Далее естественно рассмотрение вопросов дальнейшего превращения глутамата, а именно, каким образом аминогруппа отщепляется от Глу и в какой форме выводится из организма.

Изучение этих вопросов требует рассмотрения понятия о дезаминировании аминокислот (потеря аминокислотами аминогруппы в виде свободного аммиака и образования безазотистого остатка аминокислот). Существуют различные виды дезаминирования, в организме человека, главный путь – окислительное дезаминирование, которое может быть двух видов: прямое окислительное дезаминирование и непрямое (трансдездезаминирование).

Было установлено, что в митохондриях ткани печени, мозга, мышц находится НАД^ - зависимый фермент, который способен с большой скоростью дезаминировать одну единственную аминокислоту – глутаминовую - в условиях физиологического значения рН – 7,4. Это фермент – глутаматдегидрогеназа (ГДГ), с участием которого глутаминовая кислота подвергается прямому окислительному дезаминированию с образованием свободного аммиака, -кетоглутарата, воды и 3 АТФ (с участием ЦТЭ I типа).