Практическое занятие №4

ТЕМА: Механизм действия ферментов. Виды регуляции ферментативной активности

ЦЕЛИ ЗАНЯТИЯ: Изучить механизм действия ферментов, а также механизмы, лежащие в основе действия активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Необходимый исходный уровень

Из курса биоорганической химии студенты должны знать:

- теорию катализа;

- кинетику ферментативных реакций.

Учебная карта занятия Вопросы для подготовки к занятию

1. Механизм действия ферментов. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента.

2. Изостерические активаторы и ингибиторы ферментов: химическая природа, виды активирования и ингибирования ферментов. Биологическое и медицинское значение активаторов и ингибиторов ферментов.

3. Номенклатура и классификация ферментов.

4. Принципы количественного определения активности ферментов. Единицы активности.

5. Определение активности ферментов в диагностике заболеваний.

6. Применение ферментов как лекарственных препаратов. Представление об энзимотерапии и энзимодиагностики.

7. Понятие о сигнальных ферментах

8. Лактатдегирогеназа, характеристика изоферментов, свойства, особенности строения и локализации, клинико-диагностическое значение определения при заболеваниях сердца, печени и др.

9. Трансаминазы, виды, характеристика, локализация, клинико-диагностическое значение определения трансаминаз

10. Значение определения ферментов с целью прогноза и лечения.

11. Заместительные ферменты.

Практическая часть занятия

Лабораторная работа. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МОЧИ

Под амилазной активностью мочи понимают количество субстрата (крахмала), расщепляемого I мл мочи за определенный промежуток времени (например, 15 мин.) при 45⁰. Подразумевается, что в моче в качестве патологического компонента содержится фермент амилаза, попадающий в кровь при заболеваниях поджелудочной железы.

Принцип метода: Определение основано на нахождении максимального разведения мочи, при котором амилаза мочи еще расщепляет крахмал, т.е. в пробирке нет синего оттенка при добавление йода (образовавшиеся декстрины дадут красно - бурый цвет, желтый цвет, свидетельствующий об отсутствии крахмала). Учитывая разведение, следует рассчитывать количество крахмала, которое гидролизует 1 мл неразведенной мочи.

Ход определения: Берут 10 пронумерованных пробирок, наливают в каждую по 1 мл физиологического (0,85%) раствора хлористого натрия. Затем в 1-ую пробирку приливают 1 мл исследуемой мочи, перемешивают и промывают пипетку 5-6 кратным набором раствора из пробирки, далее 1 мл смеси переносят во 2 пробирку, перемешивают и вновь промывают пипетку и т.д. Таким образом получают разведение мочи в 2, 4, 8, 16 (и далее в геометрической прогрессии) раз.

В каждую пробирку наливают по 1 мл физиологического раствора (активатор амилазы мочи, очень слабый по своей активности) и по 2 мл 0,1% крахмала, тщательно перемешивают и все пробирки ставят на 15 минут в термостат при температуре 45⁰. После инкубации пробирки охлаждают, добавляют по 2 капли раствора йода. Для расчета берут пробирку с наибольшим разведением мочи, где нет синего оттенка, т.е. пробирку, где произошло расщепление крахмала.

Расчет разберем на конкретном примере:

1. допустим, что

расщепление крахмала произошло в 4 пробирке, где моча разведена в 16 раз, т.е

2 мл 1/16 мл мочи расщепляет -------2 мл 0,1% раствора крахмала

1 мл мочи ------------------------- ----Х мл 0,1% раствора крахмала,

отсюда:

Х = 2 х 16 =32 мл

Результат записывается так: d 45⁰/15 = 32ед., где d - диастаза мочи (амилаза). В норме она равна 16 - 64 ед. Количество амилазы в моче повышается при панкреатите, заболевании желчных путей и т.д. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

Результат:

Вывод:

Задачи для решения студентами на дом

1. При остром панкреатите происходит внутриклеточная активация трипсиногена и химотрипсиногена, в результате чего происходит разрушение тканей поджелудочной железы. Такие лечебные препараты как трасилол, контрикал, гордокс являются структурными аналогами субстратов этих ферментов. На чем основано лечебное действие этих препаратов?

Примерный ответ: так как указанные препараты являются структурными аналогами субстратов, то их применяют в качестве конкурентных ингибиторов

2.Больной с переломом костей голени поступил в травматологическое отделение больницы. Определение активности какого фермента следует провести?

Примерный ответ: при переломе кости (деструкция ткани) происходит поступление в кровь внутриклеточных ферментов, в частности щелочной фосфатазы, которая является маркером при переломах костей.

3.На клинической консультации обсуждаются анализы мочи больного панкреатитом и больного с опухолью почек. У первого больного в моче обнаружена амилаза, а у второго – трансаминаза. Почему нарастание амилазы мочи может указывать на внепочечный характер заболевания (панкреатит), а подъем на поражение почек (рак)?

Примерный ответ: появление в крови внутриклеточного фермента панкреатической железы - амилазы свидетельствует о панкреатите, тогда как трансаминазы являются маркерами на поражение различных внутренних органов (печени, сердца, почек)

4.Гомогенат печени кролика содержит фермент сукцинатдегидрогеназу (СДГ); его инкубировали с субстратом (янтарной кислотой) в присутствии малоновой кислоты. Изменится ли активность СДГ? Каким образом:

а) при увеличении концентрации малоновой кислоты;

б) при увеличении концентрации янтарной кислоты?

Примерный ответ: а) малоновая кислота является структурным аналогом сукцината, будет ингибировать реакцию СДГ по механизму конкурентного ингибирования

Б) увеличение концентрации янтарной кислоты вытеснит из активного центра фермента ингибитор и активность СДГ повысится ( при ответе предлагается студенту написать реакцию, катализируемую СДГ, а также структуру малоната).

5. Каков механизм действия сульфаниламидных препаратов, ингибирующих рост патогенных бактерий, нуждающихся в парааминобензойной кислоте?

Примерный ответ: механизм конкурентного ингибирования (при ответе предлагается студенту написать структуру ПАБК и сульфаниламида)

Дайте ответы на следующие вопросы:

1. Назовите ферменты, которые используются в клинике в лечебных целях. Укажите, при каких патологических состояниях используются такие ферменты как пепсин, гиалуронидаза, нуклеазы. Каковы причины применения ферментов с лечебной целью?

Примерный ответ: пепсин применяют при недостаточной секреции этого фермента слизистой желудка, гиалуронидазу – при заболеваниях, сопровождающих рост соединительной ткани - для рассасывания послеоперационных рубцов, рубцов после термических ожогов, артритах, гематомах, так как гиалуронидаза способствует разрушению соединительной ткани; нуклеазы применяют для лечения хронических гнойных и воспалительных процессов, они снижают вязкость гнойного содержимого, обладаеют противовоспалительным действием, при конъюнктивитах и др.

2. Приведите примеры, демонстрирующие диагностическое значение определения активности ферментов (трансаминаз, альфа - амилаза, кислой и щелочной фосфатаз, изоферментов ЛДГ) в крови.

Примерный ответ: трансаминазы определяют при инфрктах (АСТ) и гепатитах (АЛТ), амилазу – при панкреатитах, кислую фосфатазу при простатитах, щелочную при повреждениях костной ткани, так как они являются органоспецифичными.

Практические навыки, которыми должен овладеть студент по теме занятия

Должен освоить методы количественного определения ферментов в биологических жидкостях, уметь интерпретировать лабораторные данные.