книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

80 Глава 3

и малой длины. При использовании капиллярных трубок необхо­ димо на выходе из колонки ставить фильтр, чтобы частицы насадки не проникали в капилляры и не забивали их. Подвижная фаза должна проходить через кювету равномерно, без застойных зон.

с возможностями данного детектора объем кюветы должен быть минимальным.

В большинстве детекторов, применяемых в жидкостной хрома­ тографии, пузырьки воздуха вызывают шумы. Все соединения должны быть воздухонепроницаемыми, так как воздух может по­ падать в подвижную фазу и тогда, когда видимой утечки жидкости не происходит. Подвижную фазу необходимо обезгаживать вакуумированием или кипячением. На выходе из кюветы создается противодавление в пределах, допустимых для кюветы данной кон­ струкции, что повышает растворимость газа в жидкости и позво­ ляет удалить пузырьки воздуха, прилипшие к стенкам кюветы. Вы­ зывать шумы могут также попавшие в кювету грязь или несмешивающаяся фаза.

того, самописец должен иметь точный измеритель напряжения. Де­ тектор должен иметь нулевой баланс для компенсации фона, соз­ даваемого подвижной фазой. Короткопериодические шумы подав­ ляются главным образом в выходной цепи детектора. При слишком

определения постоянной времени прибора в кювету вводят рас­ творы постепенно меняющейся концентрации. Постоянная вре­ мени— это время, которое необходимо, чтобы перо самописца до­ стигло 63,2% величины пика.)

При использовании нескольких детекторов в серии мертвый объем каждого последующего детектора должен быть больше. Чаще всего объединяют ультрафиолетовый детектор и рефракто­ метр. Иногда детекторы соединяют параллельно. Однако в этом случае чувствительность будет ниже, так как приходится делить поток, и затрудняются количественные измерения, вследствие чего относительные скорости течения через кювету меняются с изме­ нением вязкости подвижной фазы. При прохождении через дели­

Б. Детектор, измеряющий поглощение в ультрафиолетовой области

На сегодняшний день наиболее широкое распространение в вы­ сокоскоростной жидкостной хроматографии получил детектор, из­ меряющий поглощение в ультрафиолетовой области (ультрафиоле-

товый детектор). Он относительно не чувствителен к изменениям температуры и скорости потока и обладает высокой чувствитель­

высоких чувствительностях можно детектировать вещества с отно­ сительно низкими коэффициентами экстинкции. Это позволяет про­ водить анализ с 3 нг вещества.

Приборы с монохроматическим источником света производит ряд фирм. Все это одноили двухлучевые фотометры, работаю­ щие в основном по одному принципу с небольшими вариациями.

Спектрофотометры с широким диапазоном длин волн в высоко­ скоростной хроматографии не используются, так как они имеют относительно низкую энергию света и стоят довольно дорого. Ис­ пользуя спектрофотометры фирмы «Гилфорд», можно детектиро­ вать образцы весом до 1 мг.

Принципиальная схема ультрафиолетового фотометра дана на рис. 3.1. Свет от источника 1 собирается линзой 2, делится на два пучка полупрозрачным зеркалом 3 и линзами 4 и 5 фокусируется на сравнительной 6 и рабочей кюветах 7. Свет из кювет вновь со­ бирается и фокусируется линзами 8 и 9 на фотоэлемент. Если фо­ тоэлемент чувствителен к энергии и других длин волн, необходимо поставить в измерительную панель поглощающий эти длины волн фильтр.

логарифмический усилитель вычитается, усиливается и подается на самописец. Некоторые приборы не имеют логарифмического уси­ лителя, но снабжены фотодетекторами с приблизительно логариф­ мическими характеристиками. Это приближение удовлетворительно только до поглощения 0,009 [2].

В УФ-фотометрах используются кюветы двух типов. Класси­ ческим типом является кювета Z-образной конфигурации, показан­ ная на рис. 3.3. Подвижная фаза посту­ пает с одного конца, омывает окошко и, пройдя через камеру кюветы, вытекает

сдругой стороны. Чтобы уменьшить

шумы или дрейф, вызываемые флук-

о

1

+ \

туацией потока, можно использовать Н-образную ячейку (рис. 3.4) [3]. Подвижная фаза, попадая через отверстие снизу в центр кю­ веты, разделяется на два потока и поступает к выходному отвер­ стию кюветы с двух противоположных сторон.

Хотя, когда меняется поглощение подвижной фазы, можно при­ менять сравнительную кювету, создать два равноценных по ско­ рости потока очень трудно. Кроме того, сравнительные проточные кюветы способствуют больше усилению шумов и дрейфа, а не их ослаблению. Однако сравнительные ячейки можно использовать для баланса чрезмерного фона, создаваемого подвижной фазой.

Иногда растворитель и другие непоглощающие соединения дают сигнал в УФ-детекторе по той причине, что происходит мно­ гократное оптическое отражение от стенок кюветы, имеющей узкое отверстие. Интенсивность этого отражения увеличивается, когда показатель преломления подвижной фазы в кювете меняется. В не­ которых случаях пучок света, попадая в кювету, сужается, ослаб­ ляя этот эффект.

Поскольку в кювете поток не является ламинарным, то это приводит к рассеиванию света в кювете. Как только вязкость или

скорость потока меняются, изменяется и характер течения, что может оказывать влияние на сигнал.

УФ-Фотометр является идеальным детектором при градиентной подаче растворителя. Многие часто используемые в жидкостной хроматографии растворители имеют низкие коэффициенты погло­ щения при детектируемой длине волны, и поэтому их градиентная подача не приводит к дрейфу нулевой линии. В ионообменной хро­ матографии рН и ионная сила могут варьироваться, не приводя

вгл. 8).

В.Флюориметрический детектор

Флюориметрический детектор измеряет энергию флюоресцен­ ции растворенного вещества, возникающую под влиянием УФ-об- лучения. Многие соединения поглощают в ультрафиолетовой об­ ласти и флюоресцируют при больших длинах волн; часто флюорес­ ценция наблюдается в видимой области. С помощью флюориметра можно детектировать многие биологические соединения, включая некоторые метаболиты, лекарственные соединения, аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Для многих соединений можно из­ готовить флюоресцирующие производные.

При работе на флюориметре свет от УФ-источника пропускается через фильтр и фокусируется на кювете, которая может иметь прямоугольную (рис. 3.5) или линейную конфигурацию (рис. 3.6). Излучение начальной длины волны поглощается фильтром, а ин­ тенсивность излучаемой энергии измеряется фотоприемником. Для гашения флюоресценции подвижной фазы можно использовать сравнительную кювету. При использовании флюориметра подвиж­ ная фаза не должна поглощать ни при начальной длине волны,

ни при длине волны, при которой происходит флюоресценция. Для сильно флюоресцирующих соединений, таких, как гуанинсульфат, чувствительность может достигать до Ю - 9 г/мл. Обычно УФ-детек-

Р и с. 3.5. Прямоугольный флюориметрический детектор.

/ — источник света; 2 — фильтр; 3 — кювета; 4—детектор.

тор чувствительнее флюориметрического и используется для ко­ личественных измерений. Однако флюориметр чаще применяют

3

• V

- о

Р и с . 3.6. Прямолинейный флюориметрический детектор.

/ — источник света; 2 — фильтр; 3 — зеркало; 4—кювета; 5—детектор; 6 — сравнительная кювета.

как специфический детектор для идентификации определенных со­ единений. Двухлучевой флюориметр для высокоскоростной хро­ матографии выпускается фирмой «LCD».

Г. Детектор по радиоактивности

Детектор по радиоактивности не получил широкого распростра­ нения, однако он наиболее пригоден для анализа меченых веществ. Этот метод детектирования имеет широкий линейный диапазон по концентрации и не чувствителен к природе растворителя. Детектор по радиоактивности можно использовать для определения веществ, дающих слабое (З-излучение, т. е. веществ, содержащих, например,

нако такой детектор можно собрать из отдельных блоков. Правда, проточные кюветы, выпускаемые промышленностью, имеют боль­ шой объем ( > 1 мл). Однако, если можно ввести поправку на уширение в кювете, то детекторы указанного типа можно прекрасно использовать для решения многих специфических проблем. Фирма «Packard Instruments* изготавливает блок, который можно при­ менить в жидкостной хроматографии высокого разрешения.

В этом методе детектирования сцинтилляторы (такие, как фто­ рид кальция, антрацен, стильбен и дифенилстильбен) помещаются так, чтобы они непосредственно контактировали с элюентом на выходе из колонки. При радиоактивном излучении в сцинтилляторе возникает световой импульс, который детектируется фото­ умножителем. Из фотоумножителя сигнал поступает в счетчик и затем на самописец.

Эффективность сцинтилляционной системы определяется как процент от общего числа распадов, приводящих к измеряемому

частицами сцинтиллятора, контактирующими непосредственно с вытекающим из колонки потоком. Аминокислоты, пептиды, белки, сахара можно анализировать таким методом с эффективностью 55% для 1 4 С и 2% для 3 Н [4].

3. Система, в ячейке которой происходит смешение потока жид­ кого сцинтиллятора с элюентом, вытекающим из колонки. В этом случае сцинтиллятор должен растворяться в подвижной фазе. Эф­ фективность — 70% для 1 4 С и 30% для 3 Н [5].

На характеристики детекторов может оказывать влияние ряд факторов: изменение оптической плотности, загрязнение или туше­ ние сцинтиллятора мобильной фазой или исследуемым веществом, хемилюминесценция, изменение скорости потока, самозагрязнение образцов, имеющих две метки, и фоновая радиация. Поскольку диффузия в жидкостях протекает медленно, используя детекторы по радиоактивности, можно остановить поток в камере и произве­ сти отсчет для какого-то отдельно пика, что повысит чувствитель­ ность метода.

Д. Полярографический детектор

Полярография — это электрохимический метод, в котором ток между поляризуемым и неполяризуемым электродами измеряет­ ся как функция приложенного напряжения. В применяемых

в жидкостной хроматографии детекторах этого типа обычно между электродами создается постоянное напряжение, в результате чего исследуемое вещество окисляется или восстанавливается. Возник­ ший ток непрерывно измеряется и записывается как функция вре­ мени. Этим методом можно детектировать на выходе из колонки

ионы металлов, нитросоединения, изомеры ДДТ, аминокис­ лоты, алкалоиды, альдегиды, кетоны и неорганические ани­ оны [6].

В литературе имеется опи­ сание трех видов детекторов указанного типа, отличающих­ ся используемыми электро­ дами.

1. Капельный ртутный элек­ трод [6] (рис. 3.7), в котором поляризуемый электрод посто­ янно обновляется поступаю­ щим потоком ртути. Элюент из колонки попадает на ртутный электрод, как бы проникая в ячейку. Неполяризуемый элек­ трод образует ртуть, остаю­ щуюся на дне ячейки. Капель­ ный ртутный электрод чрезвы­ чайно чувствителен к раство­ ренному кислороду и должен иметь интенсивное электриче-

Р и с. 3.7. Полярографический де­ тектор с капельным ртутным элек­ тродом [6].

/ — ввод; 2 — вывод; 3 — ртуть.

ское демпфирование для уменьшения шумов, вызываемых изменени­ ями в силе тока при росте и стекании ртутной капли с электрода.

2. Другой полярографический детектор, в котором исполь­ зуется электрод из импрегнированного углеродом силиконового каучука [7], показан на рис. 3.8. Элюент из колонки взаимодей­ ствует с поляризуемым электродом в небольшом пространстве, об­ разованном силиконовым О-образным кольцом чуть ниже элек­ трода. Ртуть используется для того, чтобы создать слой с высокой электропроводностью между проволочным электродом и силико­ новым каучуком. Неполяризуемый электрод изготавливают из пла­ тины и помещают внизу потока.

3. Иногда используется платиновый электрод, но он легко за­ грязняется и его необходимо часто регенерировать.

В настоящее время промышленность не выпускает таких по­ лярографических детекторов, которые бы применялись в жидкост­ ной хроматографии. Детектор этого типа трудно использовать для количественного анализа, так как площадь пика зависит от по­ движной фазы, типа колонки, скорости потока и приложенного на­ пряжения. Однако полярографический детектор отличается высо­ кой избирательностью, так как для каждого вещества существует оптимум как по величине подвижной фазы, так и по напряжению.

Р и с . 3.8. Полярографический детек­ тор с электродом из импрегнированного углеродом силиконового кау­ чука [7].

Подвижная фаза должна иметь высокую проводимость, по­ этому обычно применяют смеси воды с солью или органическими растворителями. Особые требования предъявляются к конструк­ ции ячейки, где мертвый объем должен быть минимальным, а вто­ рой электрод должен быть максимально приближен к поляризуе­ мому электроду.

Е. Детектор по теплоте адсорбции

Детектор по теплоте адсорбции [8, 9] широко применяется в жидкостной хроматографии. Это универсальный детектор, тем не менее он имеет ряд серьезных недостатков, что ограничивает его

в отдельной ячейке, заполненной той же самой насадкой, что и ко­ лонка. Измерения проводятся с помощью термосопротивлений или терморезисторов. Чаще используется выносная ячейка (рис. 3.9), так как это дает больше свободы в выборе конфигурации

ячейки и приводит к минимальным уширениям пика. Второй (сравнительный) датчик предназначен для ликвидации темпе­ ратурных эффектов, передаваемых в поток растворителя от на­ садки измерительной камеры; он запаивается в стеклянную обо­ лочку и помещается на выходе потока из камеры. Приборы этого типа производятся фирмами «Varian» и «Nester-Faust».

Поскольку термисторы с подходящим усилителем позволяют из­ мерять температуру порядка 10- 5 °С, то очень важным моментом

Ч

мистора.

является термостатирование ячейки и поступающей в нее подвиж­ ной фазы. Термостатирование с такой точностью практически не­ возможно, тем не менее большие водяные бани позволяют снизить колебания температуры (а следовательно, и дрейф и шумы) до приемлемой величины. Ячейку и длинную подводящую трубку помещают в баню термостата, где подвижная фаза принимает по­ стоянную температуру. Баня должна термостатироваться с точ­ ностью +0,003 °С.

Как показано на рис. 3.10, из-за адсорбции — десорбции полу­ чаемый сигнал имеет форму несимметричной S-образной кривой. Поэтому детектор по теплоте адсорбции используется в основном для качественного детектирования вещества в поисковых работах. Неразрешенные широкие пики трудно обрабатывать из-за их двой­ ственного характера. Для этого детектора высота пика есть функ­ ция концентрации, но так как возможны загрязнение и дезактива­ ция насадки ячейки, калибровка не постоянна,

грева термисторов чувствителен к скорости потока. В органических растворителях этот эффект достигает 2- 10- 4 °С/мин. Таким обра­ зом, постепенное изменение в скорости может приводить к дрейфу, а пульсация поршневых насосов при отсутствии хорошего демпфи­ рования вызывает постоянные шумы. Градиентную подачу раство­ рителя можно использовать только при низкой чувствительности детектирования, иначе базовая линия дрейфует из-за изменений температуры, связанных с изменением подвижной фазы.

Ж. Детекторы транспортного типа

При использовании детекторов этого типа летучую подвижную фазу перед процессом детектирования удаляют. Элюент непрерыв­ но поступает из колонки в соответствующую транспортную систему: движущуюся ленту, проволоку, спираль или цепочку. Летучая подвижная фаза испаряется, а нелетучий осадок исследуемого ве­ щества подается транспортной системой непосредственно в детекти­ рующее устройство. Преимущество систем указанного типа заклю­ чается в том, что их детектирующая способность не зависит от способа хроматографирования. На детектирующую систему не влияют химическая природа, температура и другие характеристики подвижной фазы, так как она непрерывно удаляется с.транспорт­ ной системы прежде, чем происходит детектирование вещества. Этот метод пригоден для детектирования относительно нелетучих

Детекторы транспортного типа, снабженные пламенно-иониза­ ционным детектирующим устройством, выпускает ряд фирм («Phillips», «Nester-Faust», «Руе Unicam», «Packard», «Nuclear-Chica- go»).

В детекторах этого типа проволока (или другая транспортная система) непрерывно проходит через камеру с температурой 750 °С, где она очищается пиролизом. Очищенная проволока проходит через элюент и покрывается тонкой пленкой подвижной фазы, со­ держащей определенное количество растворенного вещества, после этого она проходит через испарительную камеру, где удаляется растворитель, и поступает в камеру, где происходит пиролиз осад­ ка исследуемого вещества. Схема такого устройства, выпускаемого фирмой «Phillips», показана на рис. 3.11. Через камеру, где про­ исходит пиролиз, продувают газ и делают это так, чтобы продукты пиролиза с проволоки поступали в пламенно-ионизационный детек­ тор. Поток ионов, получаемый при сгорании продуктов пиролиза в пламени детектора, дает детектируемый сигнал.

Детекторы транспортного типа имеют линейный диапазон с фак­ тором отклика от 0,96 до 1,04 в области концентраций, перекры­ вающей приблизительно два порядка, но его чувствительность