книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

в хроматографическую колонку, обеспечивает полное уравновеши­ вание подвижной фазы внутри хроматографической колонки в ус­ ловиях, в которых она действительно используется. Хорошей пред­ варительной колонкой является трубка длиной 50 см с внутренним диаметром 6 мм, содержащая 20% неподвижной фазы на тонко измельченном (100—140 меш) диатомитовом носителе, таком, ко­ торый используется в газовой хроматографии. «Предварительную» колонку можно, если это необходимо, часто менять, это не влияет на работу хроматографической колонки и не вызывает ее старения.

3. Влияние температуры

Для оптимальной стабильности колонки подвижная фаза, «предварительная» колонка и хроматографическая колонка долж­ ны иметь одну и ту же температуру. Желательно, .чтобы темпера­ тура в системе поддерживалась с точностью более чем 0,1 °С. Кроме того, оказывая влияние на время жизни колонки, изменения в температуре могут приводить также к значительным изменениям ' во времени удерживания, а это затрудняет качественную иденти­

жизни колонки, следует предварительно насыщать подвижную фазу неподвижной, удалять кислород из системы и использовать соответствующую «предварительную» колонку. Если все эти усло­ вия будут тщательно выполняться, колонка может работать меся­ цами без значительных изменений в характеристиках.

В некоторых случаях время жизни колонки оказывается меньше предполагаемого. Причинами тому могут быть сама хроматографи­ ческая система, оборудование и используемая методика. Высокая взаимная растворимость жидких фаз обычно уменьшает время жизни колонки из-за увеличения трудностей в достижении равно­

телями с очень тонкой пленкой неподвижной фазы, может во мно­ гом зависеть от ряда непредвиденных факторов. Химические из­ менения в неподвижной фазе могут требовать преждевременной замены колонки. Такой эффект был отмечен в системе, состоящей из р, р'-оксидипропионитрила (неподвижная фаза) и дибутилового эфира (подвижная фаза). Предварительное изучение этой системы показало, что в одних случаях время удерживания образца умень­ шается по мере использования колонки, в других — увеличивается.

Жидко-жидкостная хроматография 141

Эти изменения вызваны двумя причинами. Во-первых, было обна­ ружено, что подвижная фаза не полностью насыщена неподвиж­ ной. Как указывалось ранее, недостаточно насыщенные подвижные фазы могут вымывать неподвижную фазу из носителя, что приво­ дит к уменьшению времени удерживания образца по мере исполь­ зования колонки. Во-вторых, увеличение времени удерживания образца связано с химическим изменением внутри колонки. Из-за неполного удаления воздуха во время приготовления и хранения

перекиси реагируют с (3, р'-оксидипропионитрилом так же, как и с эфиром, образуя более полярную неподвижную фазу, что приводит к увеличению времени удерживания образца. Тщательное удале­ ние кислорода из системы вакуумированием подвижной фазы или насыщение ее азотом эффективно решает эту проблему.

Перед использованием подвижной фазы желательно ее пред­ варительно очистить. Это успешно достигается пропусканием рас­ творителя через слой нейтральной или основной окиси алюминия [22]. Сосуд, содержащий подвижную фазу, необходимо непрерывно продувать азотом, чтобы уменьшить количество растворенного в ней кислорода.

Несмотря на тщательное соблюдение методик, описанных выше, иногда обнаруживается, что система с определенными жидкожидкостными хроматографическими колонками показывает непре­ рывное уменьшение времени удерживания образца. Если предпо­ лагается, что подвижная фаза предварительно насыщена непод­ вижной и что в ней не протекают нежелательные химические реакции (например, окисление неподвижной фазы), можно пред­ положить еще две дополнительные причины потери неподвижной фазы при эксплуатации колонок. Во-первых, на растворимость не­ подвижной фазы в подвижной может влиять давление внутри ко­

Во-вторых, удаление неподвижной фазы из жидко-жидкостной колонки в системе, считающейся полностью равновесной, может быть вызвано температурными изменениями внутри насадки ко­ лонки. При обычных линейных скоростях подвижной фазы силы трения могут слегка увеличить температуру подвижной фазы вну­

приводить к медленному удалению неподвижной фазы вследствие растворения ее в подвижной. Поскольку линейная скорость под­ вижной фазы в «предварительной» колонке большого внутреннего диаметра меньше, чем в хроматографической колонке, увеличение температуры внутри последней больше, чем в «предварительной» колонке, что приводит к сдвигу фазового равновесия,

142 Глава 5

Простой эксперимент показывает, что на самом деле внутри жидко-жидкостной колонки, работающей при средних линейных скоростях подвижной фазы, происходит значительное увеличение температуры. В поток подвижной фазы на выходе из метровой колонки с внутренним диаметром 2,1 мм, содержащей химически связанную насадку [2] и имеющей комнатную температуру, была установлена термопара. После замера начальной температуры че­ рез колонку пропускалась подвижная фаза при давлении 170 атм;

около 0,3 °С, что согласуется с теоретически предсказанным значе­ нием повышения температуры элюата для подобных колонок. Та­

В настоящее время не представляется возможным установить, что является главной причиной уменьшения времени жизни жидкожидкостной колонки: повышение температуры или давления. Од­ нако скорее всего основная причина — эффекты внутреннего на­ грева, и, следовательно, простое термостатирование хроматографической системы позволит избежать потерь неподвижной фазы. С этой целью целесообразно несколько повысить температуру в «предварительной» колонке, тогда поступающая в хроматографическую колонку подвижная фаза уже будет перенасыщена непод­ вижной фазой. Эмпирическое регулирование уровня насыщения, таким образом, позволяет поддерживать параметры хроматографической колонки без изменений в течение нескольких месяцев.

На стабильность колонок, применяемых в ЖЖХ, может иногда отрицательно влиять возврат подвижной фазы в резервуар для повторного использования. Обычно рециклизация подвижной фазы не рекомендуется, так как при этом в результате потери равнове­ сия или поглощения кислорода возможно изменение подвижной фазы. (Обычно используемые количества образца незначительно увеличивают поглощение в УФ-области.)

Е. Неподвижная фаза

/. Жидко-жидкостная хроматографическая система

В .настоящее время выбор неподвижной фазы для жидко-жид­ костных хроматографических систем осуществляется главным об­ разом эмпирически. Однако концепции, изложенные в гл. 4, обес­ печивают хорошую основу для выбора определенной системы из почти бесконечного их числа. Обычно для разделения полярных веществ используют полярные неподвижные фазы и относительно

неполярные подвижные фазы. Примером такого разделения может служить хроматограмма, показанная на рис. 5.7. Полярные герби­ циды на основе ароматически замещенных мочевин умеренно удер­ живаются на р,р'-оксидипропионитриле — сильно полярной непо­ движной фазе при использовании в качестве подвижной фазы дибутилового эфира.

Неполярные вещества можно разделить значительно более эф­ фективно при использовании неполярных неподвижных и поляр-

в качестве неподвижной фазы используется углеводородный поли­ мер, а в качестве подвижной фазы — водный метанол. Эту форму жидко-жидкостной хроматографии с «обращенной» фазой можно применить к анализу некоторых более полярных веществ, увеличи­ вая концентрацию воды в подвижной фазе. Пример этого эффекта

Теоретически имеется много комбинаций бинарных несмешивающихся фаз, которые можно было бы использовать в ЖЖХ,

Однако, как отмечалось в гл. 4, при отборе этих жидкостей необ­ ходимо учитывать ряд требований. Например, если применяется ультрафиолетовый детектор, подвижная и неподвижная фазы должны пропускать УФ-лучи.

Число неподвижных фаз, необходимых для разделения методом жидкостной хроматографии, меньше, чем можно было бы ожидать. Так, на распределение вещества очень большое влияние оказывает полярность подвижной фазы; незначительные изменения в природе подвижной фазы приводят к большим изменениям в относительном

Р и с . 5.8. Разделение конденсированных аро­ матических соединений методом жидкостной хроматографии с «обращением» фаз (Chroma­ tographic Methods, 820М4, Mar. 30, 1970).

1

10 20

Время, мин

удерживании. Например, если в качестве подвижной фазы исполь­ зуется гексан, а разделяемые вещества сильно удерживаются в ко­ лонке, требуемое время удерживания часто можно получить, до­ бавляя в подвижную фазу небольшие количества полярного моди­ фикатора, такого, как хлороформ или тетрагидрофуран. Установив требуемую концентрацию полярного модификатора в неполярной подвижной фазе, можно получить оптимальное распределение (см. гл. 4).

В табл. 5.3 приведено несколько примеров жидко-жидкостных систем. Этот список ни в коей мере не исчерпывающий; указанные системы лишь характеризуют типы систем, которые могут быть использованы для требуемого разделения. Высокополярные эфиры или гидроксилсодержащие вещества, например (3, р'-оксидипропио- нитрил и триэтиленгликоль, могут применяться с различными не­ полярными подвижными фазами. Для разделения менее полярных веществ следует использовать неполярные подвижные фазы, на­ пример гексан и циклопентан. Работая с веществами более высо­ кой полярности, можно модифицировать неполярные подвижные

Значительное влияние на эффективность колонки может ока­ зывать вязкость неподвижной фазы. Поскольку у колонок с по­ верхностно-пористыми носителями массоперенос в подвижной фазе ограничен, чего обычно нет в неподвижной фазе, можно ожидать, что использование вязких жидких фаз с малыми коэффициентами

к потере регулярности упаковки колонки и к понижению ее эффек­ тивности [19]. Таким образом, если это возможно, применение вяз­

Как было определено, стандартная жидко-жидкостная хромато­ графия имеет значительные ограничения. Поскольку неподвижная фаза обычно до некоторой степени растворима в подвижной фазе, последнюю необходимо предварительно насыщать неподвижной фазой, чтобы избежать постепенного удаления этой фазы из ко­ лонки. Кроме того, относительно высокие скорости потока, исполь­ зуемые в высокоскоростном разделении, иногда создают в сверх­ узких колонках сдвиговые усилия, под действием которых непо­ движная фаза может быть удалена с носителя.

Именно поэтому для заполнения колонок начали применяться химически связанные неподвижные фазы. Такие насадки имеют определенные преимущества; так, подвижную фазу не нужно пред-

варительно насыщать, отпадает необходимость в «предваритель­ ной» колонке и нет необходимости в предварительной обработке или модификации насадки. Эти новые химически связанные непо­ движные фазы в настоящее время доступны в двух различных формах.

Этерификация силикатных носителей. Этерификация силикат­ ных носителей мономолекулярным слоем органических спиртов

сн3

Время, мин

Р и с . 5.10. Разделение некоторых бензодиазепинов на дурапак-ОПН [Scott С. С , Bommer P., J. Chromatog. Sci., 8, 446 (1970)J.

дает хроматографическую насадку с химически связанной непо­ движной фазой. В результате этерификации пористого стекла порасила спиртами образуются так называемые «щетки» — фазы с прекрасными свойствами, которые можно применять и в газовой, и в жидкостной хроматографии [24]. Эти материалы под названием «дурапак» сейчас выпускаются фирмой «Waters». Пример разде­ ления, проведенного методом жидкостной хроматографии на ко­ лонке с дурапаком, показан на рис. 5.10. Эти материалы обеспечи­ вают превосходное разрешение компонентов образца; однако эф­ фективность колонки при используемых линейных скоростях

подвижной фазы относительно низка, по-видимому, из-за того, что эти насадки объемно-пористые (о разделении на «щетках» из тон­ кослойно-пористых носителей см. в гл. 9).

Разделения на этерифицированных силикатных носителях, ве­ роятно, происходят не в результате жидко-жидкостных взаимодей­ ствий, а скорее всего при этом осуществляется адсорбционное хроматографирование на мономолекулярном слое органического мо­ дификатора и за счет остаточной активности любой оставшейся на

поверхности силанольной группы. К сожалению, кремневые эфиры легко гидролизуются и термически не стойки, что ограничивает их использование.

неподвижными фазами; эти материалы обладают свойствами, цен­

с поверхностью пористой оболочки носителя зипакс, последующая полимеризация этого реагента дает соответствующее силиконовое

покрытие [21]. Полимерное покрытие может иметь функциональные группы от сильнополярных до неполярных, что обеспечивает ши­ рокую избирательность насадок. Получить требуемые хроматографические свойства можно, контролируя физические характеристи­ ки, такие, как концентрация, толщина пленки и структура (линей­ ные, сшитые полимеры и т. д.) полимерных неподвижных фаз. Специфические свойства поверхностей этих материалов со связан­ ной фазой, в частности тех, которые содержат силыюполярные функциональные группы, обеспечивают необычную селективность колонок.

Хроматографические насадки с химически связанными силико­ новыми фазами обеспечивают превосходную эффективность и стабильность колонки, снижают вероятность потери распредели­ тельной фазы из' носителя в процессе работы со стандартными жидко-жидкостными хроматографическими колонками. Кроме того, сильнополярные подвижные фазы, например хлороформ и водноспиртовые смеси, могут быть использованы для быстрого вымыва­ ния сильно удерживаемых компонентов образца без заметного из­ менения свойств хроматографических колонок. На рис. 5.11 показано разделение высокополярных замещенных ацетанилидов и сульф­ амидов, произведенное на колонках, заполненных химически свя­ занными «нитрильными» насадками с использованием в качестве подвижной фазы смеси 2-хлорпропан/гексан (1 : 1). Целесообраз­ ность использования в стандартной Ж Ж Х этой сильнополярной подвижной фазы весьма сомнительна из-за ее высокой растворяю­ щей способности по отношению к неподвижным фазам. Насадки с химически связанными органическими фазами будут играть важ­ ную роль для большинства разделений в ЖХ.

Рассмотрим коротко те требования, которыми нужно руковод­ ствоваться при выборе параметров для какого-то определенного разделения, проводимого методом ЖЖХ.

а. Хроматографическая система должна быть такой, чтобы вре­ мя удерживания образца в неподвижной фазе было относительно большим и чтобы растворимость образца в подвижной фазе была относительно низкой. На рис. 5.12 показано разделение некоторых фенольных соединений при использовании колонки с «эфирной» связанной фазой. Эта насадка обладает сильными электронно-до- норными свойствами, поэтому соединения избирательно удержи­ ваются в результате образования водородных связей.

б. Параметры системы должны быть подобраны так, чтобы пик образца вымывался в оптимальном диапазоне коэффициентов рас­ пределения, обычно от 2 до 5 (как уже говорилось в предыдущих