книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

30 Глава 1

В этом уравнении должны быть использованы объемные дисперсии, так как обычно колонки и соединительные трубки имеют различ­

эффекты вызывают мало беспокойств, в то время как в высоко­ скоростном варианте ЖХ они играют наиболее важную роль.

Для данной колонки влияние межколоночных эффектов зави­ сит от величины k' растворенного вещества. Если к' увеличивается, Ocoi также увеличивается, а относительная влажность oex-coi при этом уменьшается. Поэтому оценить влияние оборудования на ка­ жущуюся эффективность данной колонки можно по форме кривой зависимости Н от v для неудерживаемого пика. Если форма кри­

лоночные эффекты важны. Дисперсия в колонке зависит также от длины последней (чем дольше компонент находится в колонке, тем шире хроматографическая полоса); так что межколоночные эффекты более важны для коротких колонок. Таким образом, из­ меряя непосредственно Н для неудерживаемого компонента как функцию длины колонки при данной линейной скорости и экстрапо­ лируя к нулевой длине, можно определить изменения межколоноч­ ных факторов. В работе [14] межколоночные эффекты в хромато­ графии обсуждаются более полно.

Наконец, при обсуждении Rs и Н предполагались условия ли­ нейного вымывания, при которых получаются симметричные гаус­ совы пики. В высокоскоростной ЖХ чувствительность детекторов такова, что для получения линейной изотермы необходимо прово­ дить анализ с небольшими образцами. При использовании твердого

Асимметрия полосы («хвосты») может также возникать из-за плохого ввода пробы, когда образец поступает в колонку в виде экспоненциальной, а не цилиндрической зоны. Асимметрия пика нежелательна по двум причинам: во-первых, с уширением полосы уменьшается разрешение; во-вторых, положение максимума пика

становится минимально возможным (минимальное время анализа), во-вторых, сохраняя tRl постоянным, найти условия, при которых Rs становится как можно больше (нормализованное время). Рас­

является важным параметром, любое разрешение, большее ука­ занного, может значительно снижать скорости анализа.)

v

и [в соответствии с уравнением (1.16)] меньше длительность ана­ лиза. Следовательно, если осуществить разделение трудно, первой задачей является отбор фаз, обеспечивающих максимальное зна­ чение а. В последующем обсуждении будет предполагаться, что для данной пары веществ подобрана хорошая неподвижная фаза и значение а будет считаться постоянным. Теперь рассмотрим дру­ гие параметры, позволяющие уменьшить величину tR.

На рис. 1,9 показана типичная зависимость H/v от v, характе­ ризующая влияние v на длительность анализа. Заметим, что с увеличением скорости H/v вначале резко падает, достигая опреде* - ленного уровня. В газовой хроматографии, где Н = Cv при скоро­ стях, несколько больших У о п т , отношение H/v становится постоян­ ным. В жидкостной хроматографии члены А и См объединены, H/v непрерывно уменьшается с увеличением скорости; наклон кривой, однако, очень мал. В работе [15] можно найти экспериментальное подтверждение такого поведения в ионообменных колонках. Опти­ мальной линейной скоростью v'onr для быстрого анализа может считаться скорость, по достижении которой наклон кривой зависи* мости H/v от v меняется уже незначительно, В ГХ эта скорость,

так как H/v уменьшается медленно. Однако увеличение скорости приводит к увеличению перепада давлений АР в колонке. Перепад давления связан с линейной скоростью через проницаемость ко­

садки *. Во многих случаях давление является определяющим па­ раметром в ЖХ, и именно оно может лимитировать скорость и разделительную способность колонки.

Поскольку вязкость жидкости по крайней мере в 100 раз боль­ ше, чем у газов, то и перепад давления при данных L , v и К0 в ЖХ

где е — пористость между частицами**. Для регулярно упакован­ ных колонок е = 0,42, так что с достаточной точностью можно запи­ сать [5] ***, что

Как уже отмечалось, в жидкостной хроматографии используются частицы с диаметром в б и более раз меньшим, нежели в газовой (причину этого мы коротко рассмотрим позднее).

Таким образом, опять убеждаемся, что перепад давлений в ЖХ значительно выше: в ГХ обычное давление составляет 1,2—2,5 атм, в то время как в высокоскоростной ЖХ оно достигает 30—180 атм.

*Это уравнение справедливо для регулярно упакованных колонок.

**Заметим, что f и в совсем не одно и то же. Для колонок, упакованных

стеклянными шариками, е = /. Для пористых насадок е as '/2/ при / « 0,84.

*** Уравнения (1.28) и (1.30) обычно используются в ЖХ для проверки системы с диагностической целью. Так, зная диаметр частиц насадки, можно определить К0 и затем рассчитать перепад давления, достигаемый при данной линейной скорости для определенной длины колонки. Если предсказанный и экспериментально определенный перепады давлений различаются более чем на 20%, вероятно, в системе имеется течь или пробка. Установлено, что при нали­ чии пробки экспериментальное и рассчитанное значения АР обычно отличаются друг от друга в 2 и более раз.

34 Глава 1

подробнее в разд. Г, где будут обсуждаться особенности высоко­ скоростной хроматографии.

Как отмечалось раньше, для оценки эффективности разделения успешно используется понятие «эффективная тарелка» или «эф­

например, в том случае, когда механизм уширения пика опреде­ ляет в основном массоперенос в подвижной фазе), то тогда функ­ ция к' будет непосредственно связана с соотношением Neff/t. Опти­ мальное значение к', как видно из графика, равно 2. Более высо­ кие значения к' приводят к более долгому удерживанию; более низкие значения к' — к низким значениям Neff. Если предположить, что Н является функцией к' (важны вклады в уширение полосы, вызванные процессами массопереноса в стационарной фазе или диффузией в застойной подвижной фазе), оптимальное значе­ ние к' колеблется в пределах от 1,5 до 4.

Рис. 1.10 поясняет и некоторые другие моменты. Во-первых, по­ скольку максимум на приведенной кривой достаточно широк и ор-

4. Емкость пика

До сих пор мы говорили о разделении двухкомпонентной си­ стемы, предполагая, что те же самые основные принципы могут быть использованы при разделении многокомпонентной системы. Для анализа многокомпонентной системы, как уже отмечалось, важно число теоретических тарелок, и в данном разделе объяс­ няется, чем это вызвано.

Чтобы облегчить количественную оценку многокомпонентного анализа, Гиддингс ввел термин емкость пика [22]. Если предполо­ жить, что число теоретических тарелок постоянно (не зависит от ft'), то емкость пика можно определить как числов пиков, ко­ торые можно получить за такой период времени, на протяжении которого все полосы имеют разрешение, равное единице. Первая хроматографическая полоса элюируется во время выхода несорбируемого вещества, а максимум последней соответствует концу хроматографирования *. Если предположить, что разделение равно 4а, то пиковую емкость Ф можно определить с помощью следующего выражения:

ляется функцией корня квадратного из числа теоретических таре­ лок колонки. Таким образом, для данного коэффициента емкости последнего компонента при увеличении числа теоретических таре­ лок пиковая емкость растет. Кроме того, рис. 1.11 показывает, что, когда пиковая емкость недостаточна для данного разделения, уве­ личение ft' улучшает Ф колонок с большим числом теоретических тарелок.

Если исходить из такой характеристики, как емкость пика, то

* Для получения последнего пика необходимо очень небольшое время, так как врзвратом ня базовую линию пренебрегают,

2*

жидкостной хроматографии, где используются поверхностно-по­ ристые насадки, емкость опять мала, однако ее можно увеличить посредством более подходящего термодинамического распределе­ ния. В итоге емкость пика в гель-проникающей хроматографии ГПХ значительно меньше, чем в газовой или жидкостной хромато­ графии.

Хорват и Липский [23] отмечают, что емкость пика для газовой или жидкостной хроматографической системы можно значительно повысить при использовании одного или нескольких градиентных

Р и с . 1.11. Кривая зависимости log (1 + k') от Ф, емкости пика для двух колонок различной эффективности.

30

Ф

методов, таких, как градиентная подача растворителя или про­ граммирование температуры. Это происходит из-за того, что все пики элюируются с одной и той же шириной, и, таким образом, хроматографически определяемое число теоретических тарелок уве­ личивается с ростом k'. Так, число тарелок, требуемое для разре­ шения 100 компонентов, в обычной элютивной хроматографии мо­ жет быть равно 25 000, в то время как при градиентной подаче растворителя оно, вероятно, равно 700. Метод градиентной подачи растворителя используется не только для достижения пиковой ем­ кости, но и для решения основных проблем элюирования: группи­ рования компонентов в начале хроматограммы и длительного вре­ мени, требуемого для вымывания самых последних пиков. Метод градиентной подачи растворителя подробно обсуждается в гл. 6.

Г. Высокоскоростная жидкостная хроматография

В большинстве методов классической жидкостной хроматогра­ фии используются такие пористые насадки, как силикагель, окись алюминия и ионообменные смолы. В адсорбционной (включая ионообменную) хроматографии эти материалы применяются по-

Если исходить из общих соображений, то в высокоэффективной хроматографии лучше всего применять носитель в виде сфериче­ ских частиц, так как они упаковываются более плотно и воспроиз­ водимость упаковки лучше, чем при применении частиц неправиль­ ной формы. Для регулярно упакованных колонок (dc/dp > 10) плотное заполнение будет приводить к лучшему поперечному сме­ шению подвижной фазы из-за разрывов в потоке за счет препят­ ствующих частиц. По этой же самой причине распределение частиц по размеру должно быть узким. Широкое распределение будет при­ водить к сегрегации между большими и малыми частицами в ко-

лонке. Так как проницаемость пропорциональна dp, такое разде­ ление будет создавать зону подвижной фазы различной линейной скорости. Если сегрегация происходит по всей длине колонки, ли­ нейная скорость будет неодинаковой. Сглаживание неравномерно­ сти в результате диффузии и конвекции тогда может быть затруд­ нено, особенно в высокоскоростной ЖХ.

Ввиду важности роли подвижной фазы в жидкостной хромато­ графии тщательно исследуется способ заполнения колонки. Снайдер [34] опубликовал обзор различных методов заполнения, целью каждого из которых является создание материала носителя с оди­ наковой плотностью поперечного сечения и стремление упаковать его как можно плотнее. Используемые в высокоскоростной ЖХ ча­ стицы малого диаметра иногда бывает трудно упаковать в колонки. Насадка из частиц размером более 20 мкм хорошо работает при сухой упаковке колонки, если упаковка проведена тщательно. Не следует применять позонную вибрацию, лучше вибрировать всю колонку. Для уплотнения носителя можно использовать мягкую утрамбовку стеклянной палочкой.

Эксперименты показывают, что при упаковке сухим способом частицами меньше 20 мкм трудно достигнуть высокой эффективно­ сти и воспроизводимости. Снайдер [34] обнаружил, что упаковку частиц такого размера лучше проводить суспензионным методом. Очевидно, что при таких малых диаметрах частиц их поверхност­ ная энергия становится достаточно большой, так что при заполне­ нии сухим способом происходит значительная агломерация. Если же частицы влажные, то вокруг них возникает пленка жидкости, что препятствует их слипанию друг с другом.

Опыты показали, что для высокоскоростной ЖХ лучше всего использовать колонки диаметром 1—3 мм. В классической ЖХ при­ меняются колонки диаметром 8—10 мм или даже больше. Большая эффективность узких колонок объясняется, в частности, уменьше­ нием расстояния, на котором происходит поперечное смешение. Кроме того, в таких колонках легче сглаживаются колебания ли­ нейной скорости. Помимо повышения эффективности (при опреде­ лении линейной скорости подвижной фазы), узкие колонки при­ водят к более высоким линейным скоростям при данной объемной скорости, что, безусловно, желательно в высокоскоростной