книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

деленном соотношении, будет иметь требуемую активность. Неко­ торые используемые пары растворителей даны в табл. 4.5.

Таблица 4.5

Использование пар растворителей для перекрывания диапазона активности растворителя

Серия А

Пентан/метилацетат (6^ = 7,1 —9,8) Метилацетат/метанол (9,8—12,9) Метанол/вода (12,9—21)

Серия Б

Пентан/диоксан (6^ = 7,1—9,8) Диоксан/диметилсульфоксид (9,8—12,8) Диметилсульфоксид/вода (12,8—21)

Серия В

СН2 С12 —1,2-дихлорэтан/нитрометан (9,6—11,0) Нитрометан/1,3-дицианопропан (11,0—13,0)

Д. Активность растворителя в адсорбционной хроматографии

Элюотропные серии обнаруживают гораздо большее постоян­ ство (т. е. меньшую чувствительность к типу образца) в адсорб­ ционной хроматографии, чем в распределительной. Приведенные в табл. 4.2 значения е'° определяют одну такую серию для адсорбции на окиси алюминия. Малоактивные растворители имеют низкие значения е°, а активные — большие значения е°. Абсолютные зна­ чения параметров активности растворителя меняются при переходе

графии значениями е° можно руководствоваться при выборе ра­ створителя нужной активности, так же как значениями б руковод­ ствуются при выборе растворителя в распределительной хромато­ графии,

Причина различий в постоянстве элюотропной серии в адсорб­ ционной и распределительной хроматографии в следующем. В ад­ сорбционной хроматографии существует конкуренция между ра­ створителем М и молекулами образца X за поверхность адсорбции или неподвижной фазы:

Адсорбция молекул образца, находящихся вначале в фазе раство­ рителя Хм, требует замещения некоторого числа п первоначально адсорбированных молекул растворителя Ма с поверхности адсор­ бента. Полная энергия адсорбции АЕа определяется отношением адсорбированных и неадсорбированных молекул образца (и k');

с левой стороны указанной выше реакции минус энергия взаимо­ действия компонентов с правой стороны:

АЕа = ЕХа + пЕМм - ЕХм - пЕМа.

По ряду причин член, учитывающий энергию раствора в этом уравнении, менее важен и в первом приближении им можно пре­ небречь (см. [8]):

жается как энергия взаимодействия молекулы образца в адсорби­ рованной фазе минус n-кратная энергия взаимодействия молекулы растворителя в адсорбированной фазе. Эти энергии взаимодей­

створителя и адсорбента. Как отмечалось выше, это справедливо для случая первого приближения, особенно для мало или умеренно активных растворителей.

С практической точки зрения выбор растворителя требуемой активности в адсорбционной хроматографии гораздо проще, чем в распределительной. В адсорбционной хроматографии проще выя­ вить требуемое значение е° для данного образца, кроме того, там исключается проблема отбора несмешивающихся неподвижной и

подвижной фаз. В случае очень активных растворителей е° пока­ зывает такую же зависимость от типа образца, как и 6 в распре­ делительной хроматографии. В обоих случаях причина одна и та же: изменение важности взаимодействия с участием дисперсионных сил, дипольных и водородных связей растворителя и образца (между адсорбентом и растворителем или образцом в адсорб­

тем же самым путем, что и для распределительной. Так, раствори­ тели с большими значениями ба будут иметь для таких образцов, как спирты и фенолы, относительно большие значения е°. Подоб­ ным образом использование бинарных смесей растворителей, пере­ крывающих диапазон в значениях е°, будет приводить к относи­ тельно большей надежности элюотропных серий.

В работе [11] проведена корреляция между е° и б для различ­ ных растворителей с позиций проведенного обсуждения. Как пока­

Е.Селективность растворителя в распределительной

иадсорбционной хроматографии

Обычно, если для данного образца найден растворитель требуе­ мой активности, можно считать, что проблем больше нет. В неко­ торых случаях, однако, одна или более пар пиков образца имеют такие близкие значения k', что разделение оказывается все же не­ достаточным. Казалось бы, что в этом случае целесообразно уве­ личить эффективность разделения N, но если значения k' обоих пиков в сущности одни и те же, это не поможет. Вместо этого мы должны изменить относительные значения k' обоих соединений, но так, чтобы значения k' для каждого пика находились внутри диа­ пазона оптимальных значений: 1^/г'<10 . В адсорбционной хро­ матографии этого можно достигнуть, изменив состав растворителя [12]. Если раньше мы рассматривали такие растворители, у кото­ рых параметры 60 , ба и т. д., согласно условиям разделения, дол­ жны были меняться соответственно активности растворителя (т. е. раствор'ители с одинаковой активностью, имеющие одни и те же значения б<г, б0 и т. д.), то теперь нас интересуют такие раство­ рители, у которых общая активность б оставалась бы постоянной

Ранее мы ставили перед собой задачу подобрать такие раство­ рители, у которых относительная активность была бы одинаковой для всех типов образцов. Но в рассматриваемой ситуации это. при­ вело бы к тому, что пики с равными значениями k' в одном раство­ рителе имели одинаковые значения k' во всех растворителях. Вполне понятно, что это нежелательно, если мы пытаемся разде­ лить два пика.

Например, предположим, что имеется два неразрешенных пика (распределительная хроматография)—кетон А и спирт В. Далее

будет взаимодействовать с растворителем сильнее, чем А, так что значение k' для В будет меньше, чем для А. Таким образом эти два пика могут быть разделены. В данном случае лучшими раство­

Даже когда природа двух неразрешенных соединений неиз­ вестна, чтобы повысить вероятность правильности выбора раство­ рителя, нужно использовать тот же самый принцип: оставляя по­ стоянным значение б, одновременно менять 60 , ба и бд. При этом любое изменение во взаимодействии диполей или взаимодействии с участием водородных связей будет приводить к изменению

относительных значений k' рассматриваемых соединений. В каче­ стве примера приведем одну из таких групп растворителей (при­ меняется в распределительной хроматографии):

Подбор растворителей с целью изменения селективности в ад­ сорбционной хроматографии несколько более сложен, чем в рас­ пределительной, хотя и в первом случае могут быть использованы те же самые допущения, о которых говорилось выше. При исполь­

В случае недостаточно активных растворителей, где взаимо­ действия диполей и взаимодействия с участием водородных связей менее важны, можно предвидеть, что в адсорбционной хроматогра­ фии селективность растворителя будет менее резко выражена. Хотя этот метод не относится к числу точных, тем не менее путем подбора растворителя можно весьма существенно изменить значе­ ния k' вещества, как это показано в табл. 4.6 на примере 1-ацето- нафталина и 1,5-динитронафталина, элюированных из 4% Н2 0/окись алюминия. Коэффициент разделения а для этих двух

ружено корреляции между селективностью растворителя и значе­ ниями б0 , ба или бд образца или растворителя. Более того, селек­ тивность растворителей изменяется постепенно для всех соединений образца при переходе от неполярных растворителей (б = 6d) к ра­ створителям, содержащим компоненты повышенной полярности (например, пиридин и диметилсульфоксид). В результате макси­

Ж. Несмешиваемость фаз в распределительной хроматографии

Как отмечалось выше, несмешиваемые жидкости для распре­ делительной хроматографии отбирались эмпирически, так как пред­ сказать это достаточно точно не представляется возможным. Целе­ сообразно, не вдаваясь в подробности, рассмотреть основные фак­ торы, определяющие несмешиваемость, используя при этом пара­ метры теории растворимости. Теплота смешения двух жидкостей, i и /, рассчитывается с помощью следующего уравнения:

меньше способность к смешению. Как следует из уравнения, жидкости скорее всего не будут смешиваться, если i и (или) / имеют большие мольные объемы и значительно отличаются по параметрам растворимости. Однако поскольку вязкость подвиж­ ной фазы должна быть низкой, ее моляльный объем не может быть очень большим. Вязкость неподвижной фазы интересует нас в меньшей степени, поэтому для увеличения несмешиваемости фаз можно использовать высокомолекулярные соединения.

В то время как уравнение (4.4) оказывается нереальным, так как б учитывает вклады дисперсионных, дипольных и других сил,

3. Общая проблема вымывания

На рис. 4.4 приведена хроматограмма, полученная при разде­ лении специально приготовленной семикомпонентной смеси мето­ дом адсорбционной хроматографии на силикате с использованием

в качестве растворителя пентана. Компоненты смеси имеют самые разные значения к', и вначале вымываются те из них, у которых значения k' малы, последними же вымываются компоненты с чрез­ вычайно большими значениями k'. В результате первые пики плохо разрешимы, а пики последних компонентов, для элюирования кото­ рых необходимо избыточное время, уширяются до уровня, где чув­ ствительность детектирования значительно понижена.

Время, мин

Р и с . 4.4. Разделение специально приготовленной смеси на силикате (раство­ ритель — я-пентан).

Возможны даже такие случаи, когда некоторые пики, вымывае­ мые первыми, будут полностью неразрешены, а вымываемые по­ следними вообще не будут обнаружены.

Эффективное решение общей элюционной проблемы требует из­ менения скорости перемещения пиков во время разделения. Имеет­ ся несколько путей, с помощью которых этого можно добиться:

1) градиентная подача растворителя, или программирование растворителя;

2)программирование температуры;

3)программирование скорости потока;

4)повторное разделение при измененных условиях;

5)использование набора колонок (программирование непод­ вижной фазы).

Обсудим последовательно каждую из этих методик, останав­ ливаясь на их преимуществах и недостатках и рассматривая усло­ вия, необходимые для оптимального разделения. Детально эта методики рассмотрены в работах [14—16].

Прежде чем перейти к обсуждению перечисленных методик, следует указать, какими критериями надо руководствоваться при выборе определенной методики. Очевидно, что во всех точках хро-

состоянии. Методика должна быть приемлемой для всех типов детекторов, применяемых в ЖХ. Чувствительность детектирования (которая заметно зависит от k' при нормальном элюировании) должна быть одинаково высока для всех пиков.

В табл. 4.7 дано краткое резюме пяти м.етодик в соответствии

сэтими различными требованиями.

1.Градиентная подача растворителя

Градиентная, или пошаговая, подача растворителя предусмат­ ривает изменение состава растворителя в процессе разделения, приводящее к возрастанию активности растворителя к концу раз­ деления. В этом случае значение k' каждого элюируемого пика при его прохождении через колонку приблизительно оптимально. В ре­ зультате градиентная подача растворителя приводит к исключи­ тельному разрешению в единицу времени образцов с большим диапазоном значений k', и это преимущество перед другими мето­ диками становится еще более значительным по мере увеличения отношения величин k', соответствующих последним и первым пикам. Когда это отношение превышает 1000, приемлемыми мето­ диками можно считать только градиентную подачу растворителя и повторное разделение.

Оборудование и методика эксперимента, необходимые для вы­ сокоразрешимой ЖХ с градиентной подачей растворителя, относи­ тельно сложны, и это в значительной степени препятствует широкому распространению данного метода. После разделения с градиентной подачей растворителя колонку необходимо регене­ рировать, вымыть из нее последнюю порцию градиента раствори­ теля. При градиентной подаче растворителя чувствительность детектирования достигает максимума для пиков, вымываемых по­ следними, но данная методика исключает возможность использо­ вания рефрактометрического детектора или детектора по теплоте адсорбции.

Если не принимать во внимание эти ограничелия, очень хоро­ шее разрешение' при градиентной подаче растворителя, наблюдае­ мое при хроматографировании образцов с широким диапазоном значений к', предопределяет выбор методики в таких случаях. Градиентная подача растворителя также хорошо подходит для анализа образцов неизвестного состава, поскольку обеспечивает хорошее разрешение для образцов с большим диапазоном поляр­ ности. В работе [15] детально рассматривается оптимизация гра­ диентной подачи растворителя. Требования в отношении градиента растворителя или программы подобны таковым для элюотропных серий; б или е° должны увеличиваться линейно во времени, а б0 , 6а и б/i должны непрерывно увеличиваться в процессе разделения (т. е. не должно быть флуктуации).

Программирование температуры обычно заключается в увели­ чении температуры колонки во время разделения (см., например, [17]). В результате величина k' различных пиков, как и при гра­ диентной подаче растворителя, снижается во время разделения. Главная проблема в программировании температуры — снижение разрешения в результате изменения вязкости растворителя, вы­ зываемого изменением температуры растворителя. Программиро­ вание температуры редко используется в ЖХ из-за пониженного разрешения и ограниченной возможности обеспечить разделение образцов широкого диапазона. В адсорбционной хроматографии после разделения обычно необходимо проводить регенерацию колонки, так как при программировании температуры невозможно обеспечить постоянное содержание адсорбированной воды (см. гл. 6).

Программирование потока состоит в уменьшении линейной скорости растворителя на начальном этапе разделения и повыше­ нии ее в конце разделения. Таким путем эффективность разреше­ ния переносится с последней части хроматограммы (где часто в ней нет необходимости) на начало (где это необходимо в общей проблеме элюирования). Программирование потока обеспечивает только увеличение разрешения полос, находящихся на краю хро­ матограммы, и методика используется для образцов с очень широ­ ким диапазоном k'.

Основное достоинство — простота оборудования и применения, которые будут изредка делать использование этих методик стоя­ щими.

3. Повторное разделение

При повторном разделении один и тот же образец разделяют несколько раз, используя различные экспериментальные условия. Таким образом можно оптимизировать значения k' для различных компонентов образца, а окончательные данные можно получить, объединяя результаты разделения. Примером может служить хорошо известный двухколоночный метод, используемый для ана­ лиза аминокислот. На одной колонке разделяются и определяются кислые аминокислоты, на другой—основные аминокислоты. Недо­ статок повторного разделения заключается в необходимости реге­ нерации колонки, если не все компоненты образца элюированы во время разделения (как, например, при определении аминокислот, о котором говорилось выше), и сложности проведения двух или более разделений (по сравнению с одним разделением другим ме-, тодом). Повторное разделение также иногда расточительно для образца, и этот фактор будет значительным в препаративном раз­ делении.