книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

7 10

{Q—гексахлорбензод,

Градиентное элюирование обычно используется с такими детек­ торами, как УФ-фотометр, детектор по флюоресценции и транс­ портный детектор, однако в последнем случае возможны осложне­ ния, если составные части градиента не удаляются во время транспортного процесса и мешают детектированию. Например, при детектировании пламенно-ионизационным детектором в качестве подвижной фазы нельзя использовать органические буферы. При программировании растворителя особенно трудно применять так называемые универсальные детекторы, или детекторы общего свойства.

К.Получение и обработка данных

/.Самописцы

Самопишущий потенциометр должен полностью воспроизводить сигнал детектора. Характеристики выходного сигнала детектора определяют тип требуемого самописца. Многие современные детек­ торы имеют прецизионную мостовую выходную цепь и высокое выходное сопротивление, так что для них необходим самописец с более высоким входным сопротивлением, чтобы через него шли малые по сравнению с измерительной цепью токи.

При выборе самописца необходимо учитывать и некоторые дру­ гие факторы. Скорость пера должна быть больше, чем скорость сигнала, поступающего из измерительной цепи; обычно достаточен односекундный пробег всей шкалы. Устранение шумов переменного тока должно быть хорошим при 60 и 120 Гц (1-я и 2-я гармоники). Самописец должен иметь плавающую защиту и клемму заземле­ ния, чтобы он мог воспроизводить сигнал детектора при отклоне­ нии на несколько вольт от потенциала земли. Это последнее тре­ бование важно, так как выход многих современных детекторов зависит от потенциала земли. Самописец должен в случае необхо­ димости присоединяться к автоматическому интегратору шарико­ вого или дискового типа (фирма «Disc Instruments, Inc., Santa Ana, Calif.»). Отклонение пера самописца на всю шкалу должно

стоянного тока, может потребоваться дополнительный нулевой баланс.

Другие важные требования, предъявляемые к самописцу, — это число и тип перьев, способ записи, количество и величина скорости перемещения ленты. Чаще всего скорость перемещения составляет 2,5; 5; 12,5 и 25 мм/мин. Более быстрое перемещение ленты может потребоваться для очень высокоскоростной жидкостной хромато­ графии, медленное — для работы в режиме эксклюзионной хрома­ тографии.

2. Цифровой интегратор

Если аналитические измерения необходимо провести с высокой скоростью и точностью, выход детектора можно соединить с авто­ матическим устройством обработки данных. Очевидно, самое про­ стое и наиболее распространенное устройство, используемое в этих целях в аналитической лаборатории, — это числовой интегратор с печатающим устройством для автоматического измерения площади пика. Полученные-аналитические данные затем тщательно обраба­ тываются вручную. Когда в обращении находится большое число образцов или обрабатывается одновременно большое число хроматограмм, для быстрой автоматической обработки данных выход с цифрового интегратора можно непосредственно соединить с счетнорешающим устройством.

3. Счетно-решающее устройство

Наиболее общее устройство для автоматической обработки дан­ ных состоит из детектора, связанного через цифровое устройство с запоминающим устройством счетно-решающей машины. Распро­ странена также кассетная система, которая может состоять из единого блока или отдельных блоков от простого вычислительного устройства для каждого прибора до систем, в которых среднего размера вычислительное устройство может обрабатывать последова­ тельно данные группы приборов. В настоящее время стали доступ­ ны недорогие компьютеры, и хроматографист может, закодировав сигнал детектора, направить его непосредственно в небольшое вы­ числительное устройство, находящееся тут же в лаборатории.

Недавно разработан хроматограф, в котором сигнал через циф­ ровой интегратор поступает непосредственно в ЭВМ. Недостатком такого хроматографа является неполное использование возможно­ стей вычислительного устройства.

Вскоре появится цифровой интегратор с расчетным устройством, позволяющим получать данные непосредственно в единицах кон­ центрации. В недалеком будущем хроматографист сможет приоб­ рести за доступную цену цифровой интегратор, объединенный с цифропреобразующим и небольшим вычислительным устройствами, которые будут быстро и автоматически собирать и обрабатывать его данные.

Л. Техника безопасности

При изготовлении или выборе хроматографа исследователь дол­ жен не забывать, что он может работать с горючими и (или) ток­ сичными жидкостями.

/.Хроматограф

Жидкости, находящиеся при комнатной температуре под давле­ нием, имеют малый запас потенциальной энергии, поэтому хрома-

тографисту нет необходимости предусматривать специальные меры предосторожности на случай нарушения соединения или появления течи. Однако, когда система нагревается настолько, что жидкость достигает своей сверхкритической точки, появляется опасность сильного взрыва.

Чтобы предупредить возможность загорания в той части жид­ костного хроматографа, где горючая подвижная фаза может кон­ тактировать с горячей поверхностью, в системе должен быть пре­ дусмотрен ввод азота. Потенциально опасной точкой является нагревательный элемент или электрические соединения, которые могут давать искру.

При работе с механическими насосами предусматривается бло­ кировка в виде предохранительного клапана или разрывной мем­ браны, направляющих поток в сливной контейнер. Пневматические насосы постоянного давления не могут превысить заданного дав­ ления до тех пор, пока исправен регулятор, и поэтому не требуют предохранительного клапана. Так же используется и манометр, дающий сигнал соленоидному выключателю при определенном дав­ лении, который отключает питание механического насоса или пере­ крывает подачу газа в пневматический насос.

2.Вентиляция

Жидкостной хроматограф должен размещаться в хорошо вен­ тилируемом помещении. Экспериментатор может пролить жидкость или в системе может образоваться течь, а длительное пребывание на воздухе даже небольших количеств некоторых растворителей нежелательно. Вытяжка, установленная непосредственно над хро­ матографом, подобно тому, как это делается с атомными абсорб­ ционными спектрометрами, недостаточна, так как у большинства растворителей пары тяжелее воздуха и довольно быстро расте­ каются по полу. В идеале вытяжка должна помещаться около пола вблизи жидкостного хроматографа. Вытяжка должна также обес­ печивать 100%-ную смену воздуха и не должна соединяться с вы­ тяжной системой другой лаборатории.

Растворители следует хранить в хорошо вентилируемом поме­ щении, а большие количества — в отдельной части здания или на специальном складе. Для транспортировки растворителей весьма рекомендуется использовать безопасные контейнеры. Одновременно в лаборатории не должно храниться более 4 л любого токсичного горючего или в какой-то степени опасного растворителя.

Работать с токсичными растворителями необходимо в перчат­ ках, и разлитый растворитель следует немедленно вытереть какимлибо гигроскопичным материалом, который затем следует отпра-

вить на сжигание. Неводные растворители, использовавшиеся в качестве подвижной фазы, необходимо помещать в специальный контейнер, регулярно отправляемый на сжигание. Ни при каких обстоятельствах сливная линия из жидкостного хроматографа не может быть соединена со сливом лабораторной канализационной системы.

4. Работа с образцами и их хранение

При работе с токсичными или горючими образцами должна со­ блюдаться чрезвычайная осторожность. Информацию о токсично­ сти и других свойствах соединений можно найти в справочнике Сакса [20]. При исследовании в лаборатории большого числа раз­ личного типа образцов необходимы вытяжные шкафы и охлади­ тельные устройства. Для хранения токсичных или ценных образ­ цов, которые ни в коем случае нельзя пролить, удобны специальные бутылочки, позволяющие взять образец шприцем через тефлоновую крышку (фирма «Precision Sampling, Houston, Тех.»). Чтобы предупредить возможность случайного загрязнения при вводе про­ бы, иглы шприца должны все время находиться в футляре. При введении в хроматограф токсичных образцов экспериментатор дол­ жен надевать перчатки. В случае сильно токсичных образцов мо­ жет оказаться желательным ввод пробы с остановкой потока.

6.Henry R. A., unpublished data.

7.Kirkland J. J., unpublished data.

8. Scott C. D., Johnson W. F., Walker V. E., Anal. Biochem, 32, 182 (1969). 9. Kirkland J. J., J. Chromatog. Sci., 7, 361 (1969).

10.Majors R. E., Symposium on Advances in Chromatography, 1970, Miami Beach, Fla., June 2—5, 1970.

13.Kirkland J. J., paper submitted to J. Chromatog. Sci.

14.Peaker F. W., Tweedale C. R., Nature, 216, 75 (1967).

15.Scott C. D., J. Chromatog, 42, 263 (1969).

16.Scott R. P. W., Symposium on Modern Practice of Liquid Chromatography, Wilmington, Del, April 6—8, 1970.

19.Snyder L . R., in «Chromatographic Reviews*, Vol. 7, Lederer M , ed, Elsevier, New York, 1965.

20.Sax N. /., Dangerous Properties of Industrial Chemicals, Reinhold, New York, |963,

Глава 3

ДЕТЕКТОРЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

С, Бирн мл.

А. Введение

Детекторы, применяемые в жидкостной хроматографии, пред­ назначены для непрерывного определения концентрации растворен­ ного вещества в подвижной фазе на выходе из колонки. Выбор детектора имеет важное значение для аналитической жидкостной хроматографии.

В газовой хроматографии свойства газа-носителя, как правило, значительно отличаются от свойств исследуемого вещества. Поэто­ му пламенно-ионизационный детектор, детекторы по удельной теп­ лопроводности или плотности могут непосредственно применяться для определения малых концентраций исследуемого вещества в газе-носителе. К сожалению, подвижная фаза в жидкостной хрома­ тографии по физическим свойствам весьма схожа с исследуемым веществом. Поэтому для детектирования в жидкостной хромато­ графии необходимо или предварительно удалять растворитель (пла­ менно-ионизационный детектор), или использовать такие свойства исследуемого вещества, на которые не влияет подвижная фаза (ультрафиолетовый детектор), или измерять одно из общих физи­ ческих свойств раствора; в последнем случае необходимы тща­ тельная компенсация различий и температурный контроль (рефрак­ тометрический детектор). Единого универсального детектора для жидкостной хроматографии не существует, но для каждого кон­ кретного случая можно подобрать наиболее подходящий детектор. Не создан и такой детектор, который бы измерял сразу несколько физических свойств, но в случае необходимости можно использо­ вать ряд детекторов.

Существует два типа детектирующих систем: одни из них реаги­ руют на свойства раствора, другие — на свойства растворенного вещества. Детекторы первого типа измеряют на выходе из колонки изменение общего физического свойства подвижной фазы. К этому типу относятся рефрактометрический детектор, детекторы по прово­ димости и диэлектрической проницаемости. Детекторы второго типа чувствительны к таким физическим свойствам растворенного вещества, которыми не обладает в той же степени подвижная фаза; это, например, ультрафиолетовый и полярографический детекторы

76 Глава 3

и детекторы по радиоактивности. При анализе следов веществ для детекторов первого типа необходима компенсация и тщательное термостатирование. Детекторы первого типа обычно менее чувстви­ тельны и более подвержены шумам и дрейфу, что связано с трудностями контроля температуры в требуемом диапазоне значений.

Наиболее широкий диапазон применения имеют ультрафиоле­ товый и рефрактометрический детекторы, и они применяются чаще других.

Система, в которой используется поглощение в УФ-области

в диапазоне измеряемых длин волн. Ультрафиолетовые детекторы просты в эксплуатации и сравнительно мало чувствительны к из­ менениям скорости потока и температуры. При использовании де­ тектора этого типа образец, очевидно, должен поглощать при де­ тектируемой длине волны.

Дифференциальный рефрактометр используется для работы с образцами, которые не поглощают в ультрафиолетовой области. Он также довольно прост в применении и позволяет детектировать микрограммовые количества вещества. Однако дифференциальный рефрактометр чувствителен к изменению температуры и скорости потока.

Обычно прежде чем выбрать детектор, наиболее подходящий для данного исследования, приходится знакомиться с большим чи­ слом паспортных данных из разных источников, причем для каж­ дого детектора дается свой набор параметров. В этом случае целе­ сообразно иметь какие-то общие характеристики, чтобы по ним можно было выбрать подходящий детектор. В настоящее время для получения необходимой информации о применимости детектора необходимо или найти в литературе пример аналогичного исполь­ зования, или опытным путем определить, насколько пригоден дан­ ный детектор для анализа исследуемого вещества.

Перечислим основные параметры детектора. 1. Шумы: короткопериодический, длиннопериодический, дрейф нуля. 2. Чувствитель­ ность: абсолютная, относительная по образцу. 3. Линейность.

Кроме того, есть и другие рабочие параметры, которые также должны быть известны или исследованы: это дрейф базовой линии при изменении скорости потока; изменение чувствительности со скоростью потока; зависимость чувствительности детектора от тем­ пературы комнаты; чувствительность детектора к изменению тем­ пературы подвижной фазы; мертвый объем и уширение в кювете

ив подводящих трубках; простота в эксплуатации.

Втаблице приведены значения некоторых параметров для ряда детекторов.

/. Шумы

Шумы определяются как изменение в выходном сигнале детек­ тора, которое не может быть приписано веществу, проходящему через кювету. Шумы могут возникать в процессе работы прибора вследствие флуктуации температуры, колебания напряжения в сети, изменения скорости потока в кювете и т. д. При сравнении приборов очень важно сравнить экспериментальные условия, при которых получены параметры детектора.

Существует три вида шумов. Короткопериодические шумы вы­ ражаются в частых беспорядочных отклонениях в обе стороны от базовой линии на самописце. Длиннопериодические шумы выра­ жаются в волнообразном характере базовой линии. Шумы могут быть непрерывными и периодическими. Короткопериодические шумы заставляют работать с большими концентрациями вещества, а длиннопериодические — затрудняют определение положения и идентификацию малых пиков.

Дрейф — постоянное отклонение базовой линии в одну сторону шкалы самописца. Дрейф маскирует шумы, и пока величина дрей­ фа не станет сравнительно малой по отношению к значению шумов, оценить уровень последних не представляется возможным. Шумы

обычно определяются либо в процентах ко всей шкале при опре­ деленной чувствительности, либо величиной напряжения между двумя его наибольшими пиками.

2.Чувствительность

Абсолютная чувствительность детектора — это общее изменение физического параметра, приводящее к отклонению самописца на всю шкалу при максимальной чувствительности детектора с опре­ деленным значением шумов. При сравнении детекторов чувстви­ тельность определяют при равных значениях шумов. Чувствитель­ ность можно также определить как величину сигнала, равную шу­ мам. Обычно предполагается, что для детектирования необходимо, чтобы величина сигнала по крайней мере в 2 раза превышала зна­ чение шумов. Так, если шумы детектора составляют 2%, то мини­

непосредственно в детектор вводятся стандартные растворы с из­ вестными свойствами.

Относительная чувствительность по образцу определяется как минимальная концентрация исследуемого вещества, которая мо­ жет быть детектирована. В соответствии со сказанным выше это та концентрация, при которой сигнал в 2 раза превышает шумы.

Для определения относительной чувствительности для данного образца детектор необходимо поместить в жидкостную хроматографическую систему с насосом, системой ввода проб, колонкой и т. д. Система работает при постоянных скорости потока, температуре и других экспериментальных условиях. Минимально детектируемое предельное количество можно определить путем последовательного введения в хроматограф известных уменьшающихся концентраций образца. Сигнал многих детекторов первого типа зависит от свойств растворителя, так как он определяется разницей в свойствах рас­ творителя и исследуемого вещества (например, показатель прелом­ ления), поэтому чувствительность будет меняться с изменением природы растворителя. Колонка и мертвый объем хроматографической системы приводят к уширению сигнала, что увеличивает минимальный размер образца, который может быть детектирован. Необходимо учитывать, что чувствительность некоторых детекто­ ров (например, полярографического) зависит от скорости потока.

Средняя концентрация в кювете при предельно минимальном детектировании может быть приблизительно получена делением начального веса образца на объем подвижной фазы, проходящей в период выхода пика (время, за которое выходит пик, умножается на скорость потока). Концентрация в пике приблизительно равна двойной средней концентрации. Чтобы при прохождении через де­ тектор уширение пика было минимальным, объем кюветы должен быть значительно меньше (приблизительно на два порядка), чем объем подвижной фазы в пике.

измеряет концентрацию растворенного вещества на выходе из ко­ лонки, является пропорциональность сигнала концентрации раство­ ренного вещества. Во всех детекторах, используемых в жидкостной хроматографии, приближенно это требование выполняется, но ни в одном из них указанная зависимость не является линейной во всем диапазоне концентраций, где возможно детектирование (дан­ ные таблицы характеризуют верхний предел линейности для ка­ ждого детектора). Наиболее распространены два метода опреде­ ления линейности.

большом диапазоне концентраций. На практике линейность можно предположить только для тех значений с, для которых величина х лежит в диапазоне от 0,98 до 1,02.

Во втором методе линейность определяется как максимальное отклонение (в процентах) от линейности во всем диапазоне кон­ центраций и выражается как процент от отклонения на всю шкалу.

Чтобы определить диапазон линейности детектора, в колонку вводят постепенно возрастающие количества исследуемого веще­ ства и измеряют высоту или площадь полученных пиков. Все ра­ бочие параметры системы должны оставаться постоянными; изме­ рения необходимо повторять не менее трех раз. По полученным данным строится график.

Для определения х по уравнению (3.1) следует построить зави­ симость логарифма площади пика (или высоты) от логарифма кон­ центрации. Если линейность сохраняется во всем диапазоне кон­ центраций, то тангенс угла наклона кривой равен 1; в противном

случае тангенс угла наклона кривой в любой точке равен х. Чтобы ПОЛУЧИТЬ более точные значения х, рекомендуется проводить расчет на ЭВМ [1]. В случае нелинейных показателей детектора для опре­ деления концентрации можно использовать соответствующий по­ правочный коэффициент.

При выборе и использовании детектора необходимо учитывать целый ряд факторов. Все детекторы должны соединяться с выво­ дом из хроматографической колонки; мертвый объем такого соеди­ нения должен быть минимальным, поэтому с этой целью исполь­ зуются капиллярные трубки минимального внутреннего диаметра